Ca2+ signalų tyrimas hipoksijos paveiktose astrocitų kultūrų ląstelėse

Rugilė Satkauskaitė „Ca2+ signalų tyrimas hipoksijos paveiktose astrocitų kultūrų ląstelėse“ Tyrimo tikslas: naudojant optoregistracijos metodą ištirti ir palyginti parametrus spontaninių sąlyginai greitų Ca2+ koncentracijos svyravimų, vykstančių astrocitų ląstelių kultūrose, augintose normoksijos ir hipoksijos sąlygomis be ir su pridėtiniu biguanidu metforminu. Uždaviniai: 1. Įsisavinti nuo Ca2+ koncentracijos priklausančių fluorescencinių signalų registravimo metodiką bei gautų duomenų statistinės analizės metodus ir programas. 2. Išanalizavus greitus Ca2+ svyravimus astrocitų kultūrų ląstelėse, augintose normoksijos ir hipoksijos sąlygomis, įvertinti ir palyginti greitų trumpų Ca2+ koncentracijos pokyčių parametrus. 3. Įvertinti skirtingų koncentracijų biguanido metformino galimą poveikį hipoksijos sąlygomis augintoms ląstelėms. Tyrimo metodika: tirti greiti Ca2+ periodiniai koncentracijos pokyčiai žiurkių smegenų žievės astrocitų ląstelių pirminėse kultūrose, augintose normoksijos ir hipoksijos sąlygomis, taip pat pridėjus metformino prieš sukeliant hipoksijos imitaciją. Ca2+ koncentracijos pokyčių tyrimams naudota nuo Ca2+ priklausančio fluorescencininio signalo optoregistracija. Tyrimo rezultatai: Normoksijos sąlygomis augintose kultūrose greitus Ca2+ signalus demonstravo 75,5 %, o hipoksijos sąlygomis - 38,5 % visų populiacijos ląstelių. Po hipoksijos sąlygų taikymo, statistiškai reikšmingai sumažėjo astrocitų generuojamų Ca2+ signalų amplitudė iki 14,27±4,63 % (normoksijoje siekė 18,57±8,88 %). Kadangi impulsų trukmė nepasikeitė, o svyravimų periodas (normoksijoje - 11,65±3.24 s, hipoksijoje - 16,85±6,87 s) statistiškai reikšmingai išaugo, - pailgėjo pauzė tarp Ca2+ impulsų, sulėtėjo signalų generavimo gebėjimas. 1 mM metformino pridėjimas prieš hipoksiją panaikino Ca2+ svyravimus astrocituose. Tačiau 500 ir 250 μM koncentracijos metformino taikymas prieš hipoksiją padidino signalo santykinę amplitudę atitinkamai iki 16,28±7,39 % ir 16,97±6,72 %, ir sumažino svyravimų periodą iki 14,01±2,64 s ir 12,01±1,41 s. Po 500 μM metformino taikymo aktyvių ląstelių skaičius išaugo iki 47,6 %, o po 250 μM - iki 54 %. Išvados: astrocitų ląstelės, augintos normoksinėmis ir hipoksiją imituojančiomis sąlygomis, demonstravo pakankamai greitus (iki 20 s trukmės) savaiminius, nuo Ca2+ koncentracijos priklausančius svyravimus. Hipoksinėmis sąlygomis augintų astrocitų Ca2+ signalų amplitudė statistiškai patikimai sumažėjo, o periodas išaugo. Pridėjus metformino prieš hipoksiją imituojančias sąlygas buvo pastebėta: 1 mM metformino koncentracija panaikino astrocitų gebėjimą generuoti Ca2+ svyravimus, 500 μM ir 250 μM koncentracijos turėjo protekcinį poveikį - sugrąžino osciliacijų amplitudę arčiau esančios normoksijoje bei sumažino signalų generavimo periodą, padidino Ca2+ signalą generuojančių ląstelių skaičių. Ca2+ svyravimų generavimo šaltinis yra endoplazminis tinklas, o mitochondrijos atsakingos už moduliacinį poveikį Ca2+ astrocitų signalams.

Rugilė Satkauskaitė „Investigation of Ca2+ signals in astrocyte culture cells affected by hypoxia” The aim: to investigate and compare the parameters of spontaneous relatively rapid fluctuations of Ca2+ concentrations in astrocyte cell cultures grown under normoxic and hypoxic conditions with and without added metformin using the Ca2+-sensitive fluorescence registration. Objectives: 1. To master the methodology of recording fluorescence signals dependent on Ca2+ concentration as well as the methods and programs of statistical analysis of the obtained data. 2. To evaluate and compare the parameters of rapid short-term changes in Ca2+ concentration after analyzing the rapid fluctuations of Ca2+ in astrocyte culture cells grown under normoxia and hypoxia.3. To evaluate the potential effect of different concentrations of metformin on cells grown under hypoxia. Methodology of investigation: rapid changes of Ca2+ concentrations were observed in primary cortical astrocyte cultures of rat cerebral astrocytes grown under normoxic and hypoxic conditions and after application of metformin under those two conditions. Ca2+-sensitive fluorescence was used to record changes in concentrations. Research results: Rapid Ca2+ signals were observed in cultures grown under normoxic conditions - 75.5 %, and under hypoxia - 38.5 %. After application of hypoxic conditions, the strength of Ca2+ signals generated by astrocytes decreased statistically significantly - by 14.27 ± 4.63 % (under normoxia 18,57±8,88 %). The pulse duration did not change but the period also increased statistically by 16.85 ± 6.87 s (under normoxia 11,65± 3.24 s) and pause was prolonged between Ca2+ pulse generation. The addition of 1 mM before hypoxia vanished the ability of astrocyte cells to generate Ca2+ signals. The application of 500 and 250 μM metformin before hypoxia improved signal amplitudes by 16.28 ± 7.39 % (500 μM) and 16.97 ± 6.72% (250 μM) and reduced the period of oscillation 14.01 ± 2.64 s (500 μM) and 12.01 ± 1.41 s (250 μM). After application of 500 μM metformin, the number of active cells increased to 47.6 % and 54 % - after 250 μM. Conclusions: astrocyte cells grown under normoxic and hypoxic conditions showed sufficiently rapid (up to 20 s) spontaneous fluctuations depending on Ca2+ concentration. The amplitude of Ca2+ signals in astrocytes grown under hypoxic conditions decreased statistically significantly and the period increased. The addition of metformin before hypoxic conditions revealed that 1 mM metformin vanished the ability of astrocytes to generate Ca2+ fluctuations, 500 μM and 250 μM concentrations had a protective effect - restored the amplitude of oscillations closer to normoxia and reduced number of signaling periods, increased number of signaling cells. The endoplasmic reticulum serves as a source of Ca2+ fluctuations in astrocytes and mitochondria are responsible for modulating effects on Ca2+ astrocyte signals.