Ca2+ signalų palyginimas skirtingo patogeniškumo vėžinių ląstelių kultūrose

Justas Lukoševičius „Ca2+ signalų palyginimas skirtingo patogeniškumo vėžinių ląstelių kultūrose“ Tyrimo tikslas: Ištirti nervų sistemos ląstelių metabolizmo pokyčius, būdingus formuojantis vėžinėms ląstelėms, registruojant savaiminius viduląstelinius Ca2+ koncentracijos pokyčius. Uždaviniai: 1. Naudojant nuo Ca2+ koncentracijos pokyčių priklausančių fluorescencinių signalų optoregistracijos metodiką, išmatuoti savaiminius viduląstelinės Ca2+ koncentracijos pokyčius skirtingo patogeniškumo žmogaus glioblastomos (A-172 bei U-87) linijų kultūrų ląstelėse; įvertinti ir palyginti išmatuotų Ca2+ signalų parametrus. 2. Palyginti sąsają tarp endoplazminio retikulumo (ER) ir mitochondrijų A-172 ir U-87 glioblastomų kultūrų ląstelėse analizuojant Ca2+ srautų pokyčius po mitochondrijų pralaidumo pereinamosios poros (mPTP) blokados ciklosporinu A (CsA). 3. Išsiaiškinti skirtingo piktybiškumo žmogaus glioblastomų A-172 ir U-87 kultūrų ląstelių ER generuojamų Ca2+ signalų galimus mechanizmus panaudojant kofeiną (Caf) - įvairių ER receptorių blokatorių/aktyvatorių. Tyrimo metodika: Tirti savaiminiai sąlyginai greiti (2-50 s) Ca2+ viduląstelinės koncentracijos pokyčiai skirtingo patogeniškumo žmogaus smegenų vėžinių ląstelių linijų A-172 ir U-87 kultūrose, naudojant nuo Ca2+ koncentracijos priklausančio fluoroforo, Oregon Green 488 BAPTA-1AM, fluorescencinio signalo optoregistraciją. Tyrimo rezultatai: Kontrolės sąlygomis A-172 ląstelių su Ca2+ bangomis buvo 56,5 % nuo visų registruotų ląstelių skaičiaus, Ca2+ bangų vidutinė santykinė amplitudė siekė A=12,0±6,5 %, pusės amplitudės signalų trukmės vidurkis T1/2 buvo 34,9±15,4 s, o dažnis - N=2,1±0,9 įvykio per 200 s; tuo tarpu signalizuojančių U-87 ląstelių buvo 41,1 %, o jų generuojamų Ca2+ bangų parametrai: A=11,7±5,1 %, T1/2=22,4±11,5 s, N=3,7±2,3. Tik A-172 kultūroje 25 % aktyvių ląstelių be Ca2+ bangų taip pat generavo mažus, A=3-5 %, Ca2+ signalus - "pikus". Pridėjus mPTP (mitochondrijų pereinamumo poros) blokatorių ciklosporiną A (CsA, 20µM) į registravimo terpę, A-172 kultūros ląstelių Ca2+ signalų santykinė amplitudė palyginus su kontrole sumažėjo iki A=8,8±3,8 %, impulso trukmė - iki T1/2=26,0±9,4, o ląstelių su mažais Ca2+ pikais skaičius krito iki 7,6 % nuo visų signalus turinčių ląstelių skaičiaus; tuo metu U-87 ląstelių generuojamų Ca2+ bangų santykinė amplitudė, trukmė ir įvykių dažnis palyginus su kontrole statistiškai patikimai nepasikeitė - A=11,8±6,5 %, T1/2=24,1±11,3 s, N=3,3±1,3. Po kofeino (Caf, 5 mM) pridėjimo į A-172 kultūrų terpę, palyginus su kontrole išaugo ląstelių aktyvumas iki 75,9 %, įvykių dažnis per 200 s - N=3,3±1,2, amplitudė - A=12,9±5,0 %, bei patikimai sumažėjo Ca2+ signalų trukmė - T1/2=20,0±6,6 s; tuo tarpu U-87 glioblastomos kultūrų aktyvumas krito iki 10 % nuo visų registruotų ląstelių, taip pat, lyginant su kontrole, sumažėjo įvykių skaičius iki N=1,5±0,5 per 200 s registracijos bei amplitudė A=6,1±1,1 %, o vidutinė signalo trukmė reikšmingai nepakito - T1/2=24,25±10,4 s. Išvados: 1. Patogeniškesnio tipo U-87 glioblastomos kultūros ląstelių savaiminiai viduląsteliniai Ca2+ signalai buvo ganėtinai taisyklingos formos su gerai išreikštomis pakilimo ir nusileidimo fazėmis laikinėje dinamikoje ir statistiškai patikimai dažnesni ir trumpesni nei mažesnio piktybiškumo glioblastomos A-172 Ca2+ signalai, kurių laikinė dinamika atrodė kaip labai greitų pikų ir ilgų bangų kombinacija. 2. Mažesnio piktybiškumo glioblastomos A-172 kultūrų ląstelėse Ca2+ signalizacijos parametrai ir dinamika jautriai reagavo į Ca2+ srauto per mPTP blokavimą su CsA; tuo tarpu didesnio piktybiškumo glioblastomos U-87 Ca2+ viduląstelinių pokyčių parametrai nepriklausė nuo mPTP blokavimo.3. Mažesnio piktybiškumo glioblastomos A-172 kultūros ląstelių didelės amplitudės Ca2+ bangų generavimas buvo sustiprintas endoplazminio tinklo rianodino receptorių aktyvavimo kofeinu, tuo tarpu U-87 didelių Ca2+ bangų generavimas buvo slopintas kofeino, galimai dėl endoplazminio tinklo IP3 receptorių blokavimo.

Justas Lukoševičius “Comparison of Ca2+ signals in cultures of cancer cells of different pathogenicity” The aim: To investigate metabolic changes in nervous system cells associated with the formation of cancer cells by recording spontaneous intracellular Ca2+ concentration changes. Objectives: 1. Using an optical recording methodology based on fluorescence signals dependent on Ca2+ concentration changes, to measure spontaneous intracellular Ca2+ concentration changes in cultures of human glioblastoma cell lines with different pathogenicity (A-172 and U-87), and to evaluate and compare the parameters of the recorded Ca2+ signals. 2. To compare the interaction between the ER and mitochondria in A-172 and U-87 glioblastoma cell cultures by analyzing changes in Ca2+ fluxes following blockade of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) with cyclosporin A (CsA). 3. To determine the possible mechanisms of endoplasmic reticulum (ER)-generated Ca2+ signals in human glioblastoma cell cultures of different malignancy grades (A-172 and U-87) using caffeine (Caf) as a blocker/activator of various ER receptors. Methods: Spontaneous relatively fast (2-50 s) intracellular Ca2+ concentration changes were investigated in cultures of human brain cancer cell lines A-172 and U-87 with different pathogenicity, using optical recording of fluorescence signals from the Ca2+ sensitive fluorophore Oregon Green 488 BAPTA-1AM. Results: Under control conditions, A-172 cells exhibiting Ca2+ waves accounted for 56.5 % of the total number of recorded cells. The mean relative amplitude of the Ca2+ waves was A=12.0±6.5 %, the mean half-amplitude signal duration was T1/2=34.9±15.4 s, and the frequency was N=2.1±0.9 events per 200 s. Meanwhile 41.1 % of U-87 cells displayed signaling activity, and the parameters of their generated Ca2+ waves were: A=11.7±5.1 %, T1/2=22.4±11.5 s, and N=3.7±2.3. Only in the A-172 culture, 25 % of active cells, in addition to Ca2+ waves, also generated small Ca2+ signals “spikes” with amplitudes of A=3–5 %. After addition of the mPTP (mitochondrial permeability transition pore) blocker cyclosporin A (CsA, 20 µM) to the recording medium, the relative amplitude of Ca2+ signals in A-172 culture cells decreased compared to control to A=8.8±3.8 %, the signal duration decreased to T1/2=26.0±9.4 s, and the number of cells generating small Ca2+ spikes declined to 7.6 % of all signaling cells. At the same time, in U-87 cells, the relative amplitude, duration, and event frequency of generated Ca2+ waves did not change significantly compared to control values: A=11.8±6.5 %, T1/2=24.1±11.3 s, N=3.3±1.3. Following the addition of caffeine (Caf, mM) to the A-172 culture medium, compared to control conditions, cellular activity increased to 75.9 %, the event frequency increased to N=3.3±1.2 events per 200 s, the amplitude increased to A=12.9±5.0 %, and the duration of Ca2+ signals significantly decreased to T1/2=20.0±6.6 s. In contrast, the activity of U-87 glioblastoma cultures decreased to 10 % of all recorded cells; additionally, compared to control, the number of events decreased to N=1.5±0.5 per 200 s of recording and the amplitude decreased to A=6.1±1.1 %, while the mean signal duration did not change significantly - T1/2=24.25±10.4 s. Conclusions: 1. Spontaneous intracellular Ca2+ signals in the more pathogenic U-87 glioblastoma culture cells exhibited a relatively regular pattern with clearly expressed rising and falling phases in their temporal dynamics and were statistically significantly more frequent and shorter than the Ca2+ signals observed in the less malignant A-172 glioblastoma cells, whose temporal dynamics appeared as a combination of very rapid spikes and prolonged waves. 2. In the less malignant A-172 glioblastoma culture cells, Ca2+ signaling parameters and dynamics responded sensitively to the blockade of Ca2+ flux through the mPTP using CsA; meanwhile, the parameters of intracellular Ca2+ changes in the more malignant U-87 glioblastoma cells were not affected by mPTP blockade. 3. In the less malignant A-172 glioblastoma culture cells, the generation of high-amplitude Ca2+ waves was enhanced by caffeine induced activation of endoplasmic reticulum ryanodine receptors, whereas in U-87 cells the generation of large Ca2+ waves was suppressed by caffeine, possibly due to blockade of endoplasmic reticulum IP3 receptors.