Šakotos grandinės aminorūgščių degradacijos metabolizmo tyrimai navikinėse ląstelėse

Šakotos grandinės aminorūgštys (BCAA) - valinas, leucinas ir izoleucinas yra nepakeičiamos aminorūgštys, kurios atlieka ne tik audinių statybinių medžiagų vaidmenį, bet ir atlieka kitas metabolines funkcijas. Šių aminorūgščių metabolizmo pokyčiai gali turėti įtakos būdingoms navikinių ląstelių savybėms ir atspindėti sisteminius metabolizmo pokyčius, susijusius su tam tikromis navikų formomis. Šio darbo tikslas - ištirti navikinių ląstelių proliferaciją ir gyvybingumą sutrikdžius šakotos grandinės aminorūgščių metabolizmą. Tyrimo metu buvo norima nustatyti žemos koncentracijos šakotos grandinės aminorūgščių terpės įtaką ląstelių proliferacijai ir gyvybingumui, taip pat šakotos grandinės aminorūgščių metabolitų įtaką ląstelių proliferacijai ir gyvybingumui bei nustatyti, koks yra BCAT2 baltymo kiekis, po to, kai buvo nutildyta BCAT2 geno raiška ląstelėse. Tyrimams buvo pasirinktos dvi krūties navikų ląstelių linijos – MDA-MB-231 ir BCC. Ląstelių proliferacijos tyrimai buvo atliekami ląsteles skaičiuojant ant hematocitometro kameros, prieš tai jas nudažant Tripano mėlio dažu. Gyvybingumo tyrimai buvo atliekami tėkmės citometro pagalba, su Guava® Nexin reagentu ir kaspazėmis. BCAT2 baltymo kiekis nustatytas imunobloto metodu, prieš tai BCAT2 geno raišką nutildžius transfekcijos metodu. Atliktų tyrimų rezultatai parodė, kad ląstelės proliferuoja blogiau silpno sukibimo sąlygomis visų eksperimentų metu, taip pat išryškėjo žemos koncentracijos BCAA terpės ir metabolito KIV įtaka ląstelių proliferacijai. Tiek BCC, tiek MDA-MB-231 ląstelių linijos augo geriausiai 0,4 mM koncentracijos BCAA terpėje, su 1,5 mM α-ketoizovalerato (KIV), ypač šie skirtumai, lyginant su kontrolinėmis ląstelėmis, išryškėja prilipusių ląstelių tarpe, po 96 valandų nuo eksperimento pradžios, tarp silpno sukibimo ląstelių šis skirtumas taip pat matomas, tačiau yra gerokai mažesnis. Gyvybingumo tyrimai buvo atliekami su MDA-MB-231 ląstelių linija. Rezultatai parodė, kad silpno sukibimo sąlygomis augintų gyvų ląstelių skaičius išliko mažesnis viso eksperimento metu, taip pat pastebimas silpno sukibimo sąlygomis augintų gyvų ląstelių skaičiaus tolygus mažėjimas viso eksperimento metu. Taip pat buvo lyginamas prilipusių ir silpno sukibimo sąlygomis augintų ląstelių gyvybingumas, jas paveikus staurosporinu. Po tėkmės citometrijos, naudojant Guava Nexin reagentą, gauti rezultatai parodė, kad ląstelių augintų silpno sukibimo sąlygomis gyvybingumas buvo mažesnis, kaip ir ląstelių paveiktų staurosporinu. Tėkmės citometrijos, atliktos su kaspazėmis, rezultatai parodė, kad staurosporinas gerokai sumažino gyvų ląstelių skaičių ir ypač padidino mirusių ląstelių skaičių. BCAT2 geno raiškos slopinimo rezultatai parodė žemos koncentracijos BCAA terpės įtaką BCAT2 baltymo kiekiui. Per pusę sumažinus BCAA kiekį, ląstelėse BCAT2 baltymo kiekis sumažėja, tačiau ląstelėse, augintose terpėje papildytoje 1,5 mM KIV BCAT2 baltymo kiekis gerokai padidėja.

Branched Chain Amino Acids (BCAA’s) - Valine, leucine and isoleucine are essential amino acids that not only play a role in tissue building materials, but also perform other metabolic functions. Changes in the metabolism of these amino acids may affect the intrinsic properties of tumor cells and reflect systemic changes in metabolism associated with certain forms of tumors. The aim of the research – to investigate proliferation and viability of cancer cells, after BCAA‘s metabolism is disrupted. The objectives of the reasearch was to determine the effect of low concentration branched chain amino acid media, on cell proliferation and viability, as well as the effect BCAA‘s metabolites have on cell proliferation and viability and to determine the amount of BCAT2 protein after silencing of BCAT2 gene expression. There were 2 breast cancer cell lines chosen for this research – BCC and MDA-MB-231. The results of the studies showed that the cells proliferated worse under poor adhesion conditions in all experiments, however both BCC and MDA-MB-231 cell lines grew better in medium with 1.5 mM α-ketoisovalerate (KIV) and this difference is also visible between cells, that grew under low adhesion conditions. Viability studies were performed with MDA-MB-231 cell line and the results showed that the number of live cells, grown under low adhesion conditions, remained lower throughout the experiment, and a steady decrease in the number of live cells was observed throughout the experiment. Also, the viability of the cells were measured after they were affected with staurosporine. The results showed decresed number of live cells and increased number of dead cells. After BCAT2 gene silencing with siRNA, the highest amount of BCAT2 protein was found in cells, that grew in media with 1,5 mM of KIV. To conclude, cells that grew under poor adhesion conditions showed lower proliferation and viability rates and low concentration BCAA media has a negative impact on their proliferation. After silencing BCAT2 gene, the highest amount of BCAT2 protein was found in cells that grew in media with 1,5mM of KIV.