Žarnyno komensalinių bakterijų sąveikos su sergančiųjų opiniu kolitu ir sveikų individų epitelinėmis ląstelėmis vertinimas

Baigiamojo magistro darbo autorius: Inesa Kirilevičiūtė Baigiamojo magistro darbo vadovas: dr. Rūta Steponaitienė Baigiamojo magistro darbo konsultantas: j.m.d. Rūta Inčiūraitė Baigiamojo magistro darbo pavadinimas: ,,Žarnyno komensalinių bakterijų sąveikos su sergančiųjų opiniu kolitu ir sveikų individų epitelinėmis ląstelėmis vertinimas“

Darbo tikslas: nustatyti opinio kolito pacientų bei sveikų individų storosios žarnos epitelinių ląstelių atsaką mikroRNR lygmenyje į stimuliaciją Escherichia coli bei Phocaeicola vulgatus bakterijomis.

Darbo uždaviniai:

1. Charakterizuoti storosios žarnos epitelinių organoidų monosluoksnių sekretuojamų ekstraląstelinių pūslelių dydį, morfologines savybes ir baltyminius žymenis.
2. Įvertinti su opiniu kolitu siejamų mikroRNR raiškos pokyčius storosios žarnos epitelinių organoidų monosluoksniuose po sąveikos su Phocaeicola vulgatus ir Escherichia coli opinio kolito ir sveikų individų kontrolinėje grupėse.
3. Įvertinti su opiniu kolitu siejamų mikroRNR raiškos pokyčius storosios žarnos epitelinių organoidų monosluoksnių po sąveikos su Phocaeicola vulgatus ir Escherichia coli sekretuojamose ekstraląstelinėse pūslelėse opinio kolito ir sveikų individų kontrolinėje grupėse.

Tyrimo objektas ir metodai: Tiriamųjų imtis sudaryta iš LSMU Virškinimo sistemos tyrimų instituto sukauptos žmogaus žarnyno organoidų kolekcijos, kurią sudarė (i) opinio kolito pacientų (n=10) ir (ii) kontrolinės grupės individų (n=10) mėginiai. Tiriamųjų amžiaus ir lyčių pasiskirstymas abiejose grupėse reikšmingai nesiskyrė. Baigiamojo darbo tyrimo metu buvo vykdomas storosios žarnos epitelinių monosluoksnių formavimas iš organoidų kultūrų, jų kultivavimas su bakterijomis, RNR išskyrimas iš ląstelių ir ekstraląstelinių pūslelių, taikininė miRNR raiškos analizė atvirkštinės transkripcijos – kiekybinės tikrojo laiko PGR metodu ir ląstelių ekstraląstelinių pūslelių izoliavimas bei jų charakterizavimas, pasitelkiant ELISA, Cryo-TEM bei dinaminės šviesos sklaidos metodus.

Rezultatai: Atliktas tyrimas parodė, kad dauguma storosios žarnos epitelinių monosluoksnių kultūrų terpėse aptiktų ekstraląstelinių pūslelių buvo būdingo egzosomoms dydžio (~50–150 nm) ir ekspresavo specifinius žymenis (CD63 ir HSP70). MikroRNR raiškos analizei pirmiausia buvo įvykdyta išsami miRNR atranka, identifikuota 10 mikroRNR, kurių raiška storosios žarnos kriptų viršutinės dalies ląstelėse aktyvaus opinio kolito metu, palyginti su kontrole, buvo padidėjusi (log2PK > 1,5, FDR < 0,05). Identifikavus teorinius šių miRNR genus taikinius komensalinių bakterijų – Phocaeicola vulgatus ir Escherichia coli – genomuose, funkcinei analizei buvo pasirinktos šios mikroRNR: miR-135b-5p, miR-146a-5p ir miR-183-5p. Su opiniu kolitu siejamų ląstelių bei jų ekstraląstelinių pūslelių taikininė miRNR raiškos analizė kontrolės ir opinio kolito grupėse po stimuliacijos storosios žarnos epitelinių ląstelių su Phocaeicola vulgatus ir Escherichia coli bakterijomis atskleidė šių komensalinių bakterijų veiksmingumo potencialą, tačiau nustatyti skirtumai neparodė statistinio reikšmingumo lygmens. Nepaisant to, fiksuotos tendencijos atskleidė skirtingą Escherichia coli ir Phocaeicola vulgatus bakterijų įtaką kontrolinės ir opinio kolito grupės storosios žarnos epitelinių ląstelių mikroRNR raiškai bei jų išskyrimui ekstraląstelinėse pūslelėse, tačiau stipresnį poveikį miRNR raiškai parodė Escherichia coli bakterija abiejose tiriamosiose grupėse.

Išvados:

1. Iš nestimuliuotų ir Escherichia coli bei Phocaeicola vulgatus bakterijomis stimuliuotų storosios žarnos epitelinių organoidų monosluoksnių kultūrų terpių izoliuotos ekstraląstelines pūslelės buvo egzosomoms būdingo dydžio (~50–150 nm), pasižymėjo egzosomoms būdingomis morfologinėmis savybėmis ir ekspresavo specifinius baltyminius žymenis - CD63 ir HSP70.
2. Storosios žarnos epitelinių organoidų monosluoksniuose po sąveikos su komensalinėmis bakterijomis opinio kolito ir sveikų individų kontrolinėje grupėse nustatyti mikroRNR raiškos pokyčiai nepasiekė statistinio reikšmingumo lygmens. Stimuliacija Escherichia coli pademonstravo tendenciją didinti mikroRNR-135b-5p, mikroRNR-183-5p ir mikroRNR-146a-5p raišką opiniu kolitu sergančiųjų grupėje, o sveikų individų kontrolinėje grupėje – didinti mikroRNR-146a-5p ir mažinti mikroRNR-135b-5p bei mikroRNR-183-5p raišką. Phocaeicola vulgatus sukėlė nežymų, tačiau specifinį mikroRNR-146a-5p raiškos padidėjimą tik kontrolinėje grupėje.
3. Storosios žarnos epitelinių ląstelių ekstraląstelinėse pūslelėse po sąveikos su komensalinėmis bakterijomis opinio kolito ir sveikų individų kontrolinėje grupėse nustatyti mikroRNR raiškos pokyčiai nepasiekė statistinio reikšmingumo lygmens. Sąveika su Escherichia coli sąlygojo mikroRNR-146a-5p, mikroRNR-135b-5p ir mikroRNR-183-5p raiškos didėjimą opiniu kolitu sergančiųjų pacientų grupėje, o sveikų asmenų kontrolinėje grupėje – mikroRNR-146a-5p raiškos didėjimą ir mikroRNR-183-5p bei mikroRNR-135b-5p mažėjimą. Phocaeicola vulgatus opiniu kolitu sergančiųjų grupėje mažino mikroRNR-135b-5p ir mikroRNR-183-5p, o kontrolinėje grupėje – visų trijų tirtų miRNR raišką.

Author of the final master's thesis: Inesa Kirilevičiūtė Supervisor of the final master's thesis: Dr. Rūta Steponaitienė Co-Supervisor of the final master's thesis: Junior Researcher Rūta Inčiūraitė Title of the final master's thesis: "Assessment of Interactions Between Intestinal Commensal Bacteria and Epithelial Cells of Ulcerative Colitis Patients and Healthy Individuals".

Objective: To investigate the microRNA-level response of colonic epithelial cells from ulcerative colitis patients and healthy individuals following stimulation with Escherichia coli and Phocaeicola vulgatus.

Objectives:

1. To characterize the size, morphological features and protein markers of extracellular vesicles secreted by monolayers of epithelial organoids of the large intestine.
2. To assess alterations in the expression of ulcerative colitis–associated microRNAs in colonic epithelial organoid monolayers following exposure to Phocaeicola vulgatus and Escherichia coli in samples from healthy controls and ulcerative colitis patients.
3. To assess alterations in the expression of ulcerative colitis–related microRNAs within extracellular vesicles secreted by colonic epithelial organoid monolayers after exposure to Phocaeicola vulgatus and Escherichia coli in samples from healthy individuals and ulcerative colitis patients.

Subject and methods: The study utilized samples from the human intestinal organoid biobank maintained by the Institute for Digestive Research at LSMU. These included (i) samples from ulcerative colitis patients (n=10) and (ii) samples from healthy control individuals (n=10). There were no significant differences in age or sex distribution between the two groups. During the course of the study, colonic epithelial monolayers were derived from organoid cultures and co-cultured with bacteria. Subsequent procedures included RNA isolation from both cells and extracellular vesicles, targeted microRNA expression analysis via reverse transcription-quantitative real-time PCR (RT-qPCR), and the isolation and characterization of extracellular vesicles using ELISA, Cryo-TEM, and dynamic light scattering techniques.

Results: The study showed that most of the extracellular vesicles detected in colon epithelial monolayer culture media were exosome-specific in size (~50-150 nm) and expressed specific markers (CD63 and HSP70). For the analysis of miRNA expression, a comprehensive miRNA selection was first performed, identified in 10 microRNAs with increased expression in the cells of the colon crypts of the upper part during ulcerative colitis compared to the control (log2PK > 1.5, FDR < 0.05). After identifying the theoretical targets of these microRNA genes in the genomes of commensal bacteria – Phocaeicola vulgatus and Escherichia coli – the following miRNAs were selected for functional analysis: microRNA-135b-5p, microRNA-183-5p and microRNA-146a-5p. A targeted analysis of microRNA expression of ulcerative colitis cells and their extracellular vesicles in control and ulcerative colitis groups after colon epithelial cell stimulation in Phocaeicola vulgatus and Escherichia coli revealed the efficacy potential of these commensal bacteria, but the differences identified did not indicate a level of statistical significance. Nevertheless, the fixed trends revealed different effects of Phocaeicola vulgatus and Escherichia coli bacteria on the expression of miRNAs and their secretion in extracellular vesicles of the healthy control group individuals and patients with ulcerative colitis, but Escherichia coli showed a stronger effect on microRNA expression in both groups of subjects.

Conclusions:

1. Extracellular vesicles isolated from monolayer culture media of epithelial organoids of the large intestine and stimulated by Phocaeicola vulgatus and Escherichia coli bacteria were of exosome-specific size (~50–150 nm), exhibited exosome-specific morphological properties and expressed specific protein markers - CD63 and HSP70.
2. In monolayers of epithelial organoids of the large intestine after interaction with commensal bacteria, changes in microRNA expression in control groups of healthy individuals and ulcerative colitis patients did not reach the level of statistical significance. Stimulation in Escherichia coli demonstrated a tendency to increase the expression of microRNA-146a-5p, microRNA-183-5p and microRNA-135b-5p in the ulcerative colitis group and to increase microRNA-146a-5p and decrease the expression of microRNA-135b-5p and microRNA-183-5p in the healthy control group. Phocaeicola vulgatus produced a modest but specific increase in microRNA-146a-5p expression only in the healthy control group individuals.
3. In extracellular vesicles of epithelial cells of the large intestine following interaction with commensal bacteria, changes in microRNA expression in control groups of healthy individuals and ulcerative colitis did not reach the level of statistical significance. Interactions with Escherichia coli resulted in an increase in the expression of microRNA-183-5p, microRNA-146a-5p and microRNA-135b-5p in the ulcerative colitis group and an increase in the expression of microRNA-146a-5p and a decrease - microRNA-135b-5p and microRNA-183-5p in the healthy control group. Phocaeicola vulgatus reduced the expression of microRNA-135b-5p in the healthy control group and both microRNA-135b-5p and microRNA-183-5p in the ulcerative colitis group.