Kasos vėžio pacientų imunotranskriptominės analizės galimybės: PKVL ir kasos audinio mėginių bibliotekų rengimas

Kasos vėžys yra vienas iš mirtiniausių onkologinių susirgimų pasaulyje, dažniausiai diagnozuojamas vėlyvose stadijose dėl besimptomės eigos ankstyvuoju laikotarpiu ir specifinių diagnostinių žymenų stokos. Prognozuojama, kad ateityje šis vėžys gali tapti antru pagal mirtingumą po plaučių vėžio [1]. Viena iš ligos progresavimo priežasčių yra naviko mikroaplinkos sukelta imunosupresija, mažinanti priešvėžinių imuninių ląstelių (citotoksinių T limfocitų, NK ląstelių, dendritinių ląstelių) aktyvumą ir sukelianti imuninės sistemos disfunkciją [2]. Siekiant geriau suprasti molekulinius mechanizmus, susijusius su imuninio atsako reguliacija, atliekami imunotranskriptominiai tyrimai, analizuojant periferinio kraujo vienbranduolių ląstelių (PKVL) ir kasos navikinio audinio mėginius. Tokia analizė gali padėti nustatyti naujus diagnostinius biožymenis bei potencialius taikinius personalizuotam gydymui. Lietuvos mokslo tarybos (LMT) vasaros praktikos metu studentė prisidėjo prie kasos vėžio tyrimų, įgyvendinamų Chirurginės gastroenterologijos laboratorijoje. Šios praktikos temos įgyvendinimui buvo naudojami pacientų kraujo mėginiai bei kasos navikiniai audiniai. Praktikos pradžioje iš periferinio kraujo mėginių buvo išskirtos PKVL tankio gradiento metodu naudojant “Ficol” reagentą ir išskirtos ląstelės buvo krioprezervuojamos tolimesniems žingsniams. RNR išskyrimas iš PKVL vykdomas naudojant “Purelink RNA Mini” rinkinį, kurio eigoje jos yra lizuojamos, o supernatantas su išlaisvinta RNR yra perkeliamas į kitą mėgintuvėlį ir sumaišomas su 70% etanoliu. Visas mėginio tūris yra perkeliamas į kolonėles ir po centrifugavimo RNR fiksuojasi filtre, o supernatantas pašalinamas. Po RNR plovimo keliais etapais, buvo atliktas RNR tirpinimas - eliucija, kad išplautume RNR iš filtro su be nukleazių vandeniu. RNR skyrimas iš paciento audinio buvo atliekamas su „ZYMO Direct-zol RNA Mini prep “ rinkiniu, naudojant TRI reagentą su keraminiais lizavimo rutuliukais bei homogenizatorių „Roshe MagNa Lyser“. Po RNR izoliavimo spektrofotometriškai buvo matuojama RNR koncentracija ir švarumas „NanoDrop 2000“ prietaisu bei fluorometriškai RNR integralumas su „Qubit4“, taip pat RNR kokybė tikrinta su „2100 Bioanalyzer Agilent RNA 6000 Nano“ rinkiniu. Sekantis etapas atrinktų pakankamai kokybiškų mėginių (RIN >8, koncentracija >100 ng/µl, 260/280 ir 260/230 santykiai ~2) bibliotekų ruošimas, kai išskirtą RNR konvertavome į cDNR panaudojant “Collibri Stranded RNA library preparation” rinkinį. Šiame etape buvo atlikta RNR fragmentacija, hibridizacija, ligacija bei RNR konvertavimas atvirkštinės tranksriptazės pagalba į cDNR, kuri vėliau buvo amplifikuota. Vėliau gauta cDNR buvo kiekybiškai ir kokybiškai vertinama naudojant „ 2100 Bioanalyzer Agilent High Sensitivity DNA“ rinkinį. Gautos cDNR bibliotekos įvertintos kiekybiškai ir kokybiškai bei suvienodintos iki 1 nM koncentracijos sekoskaitai. Praktikos tikslas buvo paruošti bent keturių pacientų (8 mėginių) kokybiškas kasos audinio ir PKVL transkriptomo bibliotekas. Rezultatai pranoko lūkesčius – buvo paruoštas pakankamai kokybiškas šešių pacientų mėginių bibliotekų rinkinys (12 bibliotekų). Tai sudaro pagrindą tolimesnei sekoskaitai, leisiančiai tirti molekulinius imuninio atsako reguliacijos pokyčius ir identifikuoti galimus personalizuoto gydymo taikinius. Praktikos metu studentė taip pat įgijo praktinių molekulinės biologijos įgūdžių, susipažino su geros laboratorinės praktikos principais ir laboratorijoje vykdomais tyrimais.