Baltymų, išskirtų iš didžiosios ugniažolės (chelidonium majus l.) Žolės, kokybinė – kiekybinė analizė, antioksidantinio aktyvumo tyrimas bei kietųjų kapsulių gamyba

Darbo tikslas: Atlikti kokybinę – kiekybinę baltymų, išskirtų iš didžiosios ugniažolės (Chelidonium majus L.) žolės, analizę, įvertinti baltymų tirpalo antioksidantinį aktyvumą ir pagaminti su šiais baltymais kietąsias kapsules. Darbo uždaviniai:

1. Atskirti Chelidonium majus L. žolės baltymų frakcijas pagal dalelių dydį;
2. Kiekybiškai nustatyti baltymų kiekį gautose frakcijose;
3. Baltymų frakcijose nustatyti baltymų molekulinę masę;
4. Pagaminti kietąsias kapsules su baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, tirpalu;
5. Nustatyti, kiek baltymų (%) atsipalaiduoja, tirpstant kietajai kapsulei;
6. Įvertinti iš Chelidonium majus L. žolės išskirtų baltymų ir baltymų, atsipalaidavusių iš kietųjų kapsulių, antioksidantinį aktyvumą, panaudojant modelinį ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties)) radikalą – katijoną. Metodai:
7. Baltymų frakcijos pagal dalelių dydį atskirtos gelchromatografijos metodu;
8. Bradford metodu kiekybiškai nustatyta baltymų sudėtis išskirtose frakcijose;
9. NaDS – PAGE elektroforezės metodu frakcijose nustatyta baltymų molekulinė masė;
10. Kietosios kapsulės pagamintos, baltymų tirpalus džiovinant 20 ± 2°C temperatūroje kartu su adsorbentais;
11. Baltymų, išsiskyrusių iš kietųjų kapsulių, kiekis nustatytas Bradford metodu;
12. Iš didžiųjų ugniažolių žolės išskirtų baltymų ir baltymų, atsipalaidavusių iš kietųjų kapsulių, antioksidantinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriškai, matuojant mėginių gebą surišti ABTS radikalą – katijoną. Rezultatai:
13. Baltymai pagal molekulių dydį suskirstyti į 44 frakcijas;
14. Nustatyta didžiausia baltymų, išskirtų iš Chelidonium majus L. žolės, koncentracija frakcijose – 19,654 ± 0,04 µg/ml;
15. Nustatytos baltymų molekulinės masės atskirose frakcijose: 15, 20, 35 ir 38 kDa;
16. Pagamintos kietosios kapsulės su didžiųjų ugniažolių žolės baltymais. Pagalbinės medžiagos – mikrokristalinė celiuliozė Prosolv® SMCC HD 90 ir bevandenis koloidinis silicio dioksidas (aerosilas);
17. Atlikus baltymų išsiskyrimo iš kapsulių testą, po 60 minučių kapsulių tirpimo išsiskyrė 91 ± 0,58 % baltymų;
18. Maksimalus antioksidantinis aktyvumas (71,29 ± 0,9%) nustatytas, kai baltymų koncentracija tirpale buvo 7 μg/ml. Mažiausias antioksidantinis aktyvumas (8,15 ± 1,2 %) pasiektas, kai baltymų koncentracija tirpale buvo 3 μg/ml. Didžiausias baltymų, išsiskyrusių iš kietųjų kapsulių, antioksidantinis aktyvumas (35 ± 0,7%) stebėtas, kai iš kietųjų kapsulių išsiskyrė 3,85 ± 0,05 μg baltymų. Išvados:
19. Atlikus didžiųjų ugniažolių žolės baltymų gelchromatografiją, baltymai atsiskyrė tik dalinai.
20. Frakcijose nustatyta nuo 0,312 ± 0,09 µg/ml iki 19,654 ± 0,04 µg/ml baltymų koncentracija.
21. Nustatyta frakcijose esančių baltymų molekulinė masė atitiko fermentinės kilmės baltymų ir su chitinu besijungančių glikoproteinų – lektinų molekulinę masę. Reikalingi tolimesni tyrimai, norint nustatyti šių baltymų tapatybę.
22. Pagamintoje kiekvienoje kietojoje kapsulėje yra 4,86 ± 0,03 µg baltymų. Baltymų ir pagalbinių medžiagų mišinys yra tinkamas kapsuliavimui, nes pasižymi geru birumu ir atitinka Europos Farmakopėjos reikalavimus (pagal miltelių birumo greitį ir subėrimo kūgio kampą).
23. Kietųjų kapsulių gamybai pasirinktas tinkamas būdas, nes baltymų atsipalaidavimas iš jų yra efektyvus, atitinka Europos Farmakopėjos reikalavimus (iš kietosios kapsulės atsipalaidavo daugiau nei 75% baltymų per 45 min).
24. Baltymai, išskirti iš didžiųjų ugniažolių žolės, geba surišti laisvuosius radikalus. Stebėtas sumažėjęs baltymų antiradikalinis aktyvumas, pagaminus kapsules. Baltymų aktyvumo sumažėjimą galėjo lemti jų denatūracija dėl netinkamai parinktų eksperimentinių sąlygų, gaminant kapsules (temperatūros, ilgo džiovinimo ar kapsulių laikymo laiko).

Objective of work: to perform the qualitative – quantitative analysis, antioxidant activity of proteins from Chelidonium majus L. herb, to produce hard capsules with these proteins. Main tasks:

1. To fractionate proteins from Chelidonium majus L. herb by their particle size;
2. To evaluate the amount of protein in prepared fractions;
3. To assess the molecular mass of protein from Chelidonium majus L. herb in fractions;
4. To produce hard capsules with solution of proteins;
5. To evaluate the amount of protein (%) released from capsule after dissolution;
6. To evaluate antioxidant activity of protein solution and proteins released from hard capsules against ABTS free radical – cation. Methods:
7. Protein fractions, depending on their particle size, were separated by gel chromatography;
8. The amount of protein in prepared fractions was evaluated by Bradford assay;
9. The molecular mass of protein from Chelidonium majus L. herb was assesed by SDS – PAGE assay;
10. Hard capsules were produced by drying solution of proteins in 20 ± 2°C temperature with adsorbents;
11. The amount of protein (%), released from hard capsules, was evaluated by Bradford assay;
12. The antioxidant activity was evaluated by ABTS free radical – cation scavenging activity test using spectrophotometry.

Results:

1. Proteins depending on particle size were separated into 44 fractions;
2. The biggest amount of proteins in prepared fractions was 19,654 ± 0,04 µg/mL;
3. The particle size in different fractions was 15, 20, 35 and 38 kDa;
4. Hard capsules with proteins from Chelidonium majus L. herb were produced. Support materials: silicified microcrystalline cellulose Prosolv® SMCC HD 90 and colloidal silicon dioxide (aerosil);
5. The amount of protein (%), released from hard capsules after 60 min, was 91 ± 0,58 %;
6. Antioxidant activity reached 71,29 ± 0,9 % at 7 μg/ml of protein solution. Least antioxidant activity (8,15 ± 1,2 %) was achieved at 3 μg/ml of protein solution. The highest antioxidant activity of proteins, released from hard capsules, was 35 ± 0,7 %, when hard capsules released 3,85 ± 0,05 μg of proteins. Conclusions:
7. After the gel chromatography of proteins, isolated from Chelidonium majus L. herb, proteins were separated only partially.
8. The amount of protein in prepared fractions was from 0,312 ± 0,09 µg/mL to 19,654 ± 0,04 µg/mL.
9. The determined protein particle size matched up enzymatic proteins and chitin – binding glycoproteins (lectins) particle size. Further investigation is necessary to determine the sameness of protein.
10. Every produced hard capsule contains 4,86 ± 0,03 µg of proteins. Compound of proteins and support materials is suitable for encapsulation because of a good powder flow. It meets the requirements of European Pharmacopoeia (by powder flow rate and angle of repose).
11. Method of production of hard capsules was selected properly. Release of proteins from hard capsules is effective and meets the requirements of European Pharmacopoeia (hard capsule released more than 75% of proteins in 45 min).
12. Protein fractions are able to bind free radicals. This activity decreased after encapsulation of proteins. Decreased activity of proteins could be determined by their denaturation, which was caused by inappropriate conditions of producing capsules (temperature, long time of drying or storage).