Endotelinių ląstelių lokalizacijos glioblastomos ląstelių sferoido viduje tyrimai
Tamoliūnas, Jokūbas |
Pašakarnis, Laurynas | Recenzentas / Reviewer |
Bakalauro baigiamojo darbo autorius: Jokūbas Tamoliūnas Tema: Endotelinių ląstelių lokalizacijos glioblastomos ląstelių sferoido viduje tyrimai Mokslinis vadovas: Dr. Arūnas Kazlauskas Atlikimo vieta: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Neuromokslų institutas, Molekulinės neuroonkologijos laboratorija Santraukos turinys: Glioblastomos (GBM) angiogenezės procese ryškus vaidmuo tenka kraujagyslių endotelio augimo faktoriui (VEGF), kuris pasižymi padidėjusia raiška progresuojančiame navike ir dėl savo sąveikos su tiesioginiais receptoriais VEGFR bei koreceptoriais neuropilinais (NRP) sąlygoja endotelinių ląstelių migracijos, proliferacijos ir naviko metastazės procesus. Antagonistiniu efektu pasižymintis 3-čios klasės semaforinas Sema3A konkuruoja su VEGF dėl sąveikos su NRP ir taip pat aktyvuoja A tipo pleksinų signalinius kelius, slopinančius angiogenezės procesą. Šiame darbe tiriamas Sema3A ir VEGF165 hibridinio baltymo Sema-PSI-Ig-HBD anti-angiogeninis potencialas. Yra žinoma, jog šis baltymas in vitro 2D modelyje slopina angiogenezę, bet nėra jokių duomenų, kaip šis baltymas veikia endotelinių ląstelių persitvarkymą natyvų GBM naviką imituojančio erdvinio modelio viduje. Tyrimo metu GBM ląstelių linijos U87 pagrindu buvo sukurta stabili ląstelių linija U87tet- Sema-HBD, kuri tetraciklinu indukuojamu būdu sintetina Sema-PSI-Ig-HBD ir reporterinį fluorescuojantį Venus baltymus. Sėkmingas ląstelių linijos sukūrimas buvo patvirtintas „Western blot“ metodu. Iš U87tet-Sema-HBD ląstelių ir raudonai fluorescuojantį baltymą mCherry sintetinančių endotelinių HUVEC ląstelių mišinio buvo suformuoti heterotipiniai sferoidai, kuriuos, patalpinus į užlastęlinį matriksą imituojantį hidrogelį, buvo tiriamas Sema-PSI-Ig-HBD baltymo poveikis endotelinėms ląstelėmis. Rezultatai buvo lyginami su U87 kontrole. Buvo pastebėta, jog Sema-Psi-Ig- HBD baltymas in vitro neigiamai veikia tiek U87 linijos, tiek HUVEC ląstelių tarpusavio sąveiką ir sąlygoja didesnį HUVEC ląstelių išsibarstymą sferoide lyginant su kontrole. Buvo pastebėta, jog abiejų eksperimentinių sąlygu atveju HUVEC ląstelės vengia centrinės zonos ir telkiasi sferoido periferijoje. Eksperimentais patvirtinta hipotezė, jog šis išcentrine kryptimi stebimas HUVEC ląstelių migravimas vyksta dėl sferoido centre susidarančių hipoksinių sąlygų. Apibendrinant galima teigti, jog darbo metu sukurtas GBM angiogenezės tyrimo 3D modelis yra efektyvus tiriant terapinį potencialą turinčių molekulių įtaką endotelio ląstelėms, o baltymas Sema- PSI-Ig-HBD pasižymi endotelinių ir GBM ląstelių erdvinį persitvarkymą reguliuojančiomis savybėmis.
Author of Bachelor thesis: Jokūbas Tamoliūnas Title: Investigation of endothelial cells localization inside the spheroid of glioblastoma cells Scientific supervisor: Dr. Arūnas Kazlauskas Work was performed at: Lithuanian University of Health Sciences, Neuroscience Institute, Laboratory of Molecular Neurooncology Summary: Angiogenesis process of glioblastoma (GBM) is mainly driven by vascular endothelial growth factor (VEGF), which is well known to be overexpressed in progressing tumours. Through activation of its primary receptors VEGFR and co-receptors neuropilins (NRP) VEGF signaling leads to migration and proliferation of endothelial cells and thus the process of tumour metastasis. 3rd class sempahorin, Sema3A is known to have an antagonistic effect for VEGF signaling because of competition for co- receptor NRP1 binding site and activation of A type plexin downstream signaling. The aim of this work was to test the anti-angiogenic potential of Sema3A and VEGF165 hybrid protein Sema-PSI-Ig-HBD. There are scientific evidence showing that this protein inhibits angiogenesis in 2D in vitro angiogenesis models, but its effect on endothelial cells inside the native tumor environment mimicking 3D GBM model is still unknown. During the investigation, U87 GBM cell line was used to create a stable cell line, called U87tet- Sema-HBD which synthesizes Sema-PSI-Ig-HBD protein and fluorescent reporter protein Venus in the presence of tetracycline. Creation of this cell line was validated via Western blot assay. Heterotypic spheroids were formed using U87tet-Sema-HBD and red fluorescent protein expressing HUVEC cell lines. Spheroid models were submerged into the hydrogel „Geltrex“, which imitates the extracellular matrix, and the effect of Sema-PSI-Ig-HBD on endothelial cells was assessed according to the experimental U87 control. Sema-Psi-Ig-HBD protein was found to negatively impact cell to cell interactions in both – U87 and HUVEC - cell types, which led to significantly increased dispersion of HUVEC cells compared to the control. Moreover, it was observed that in all experimental conditions, HUVEC cells were accumulating in the periphery and avoiding the center area of the heterotypic spheroid. An experiment was conducted, which revealed that this directional migration of HUVEC cells, both in control and experimental conditions, was due to hypoxic environment in the center of spheroid. In conclusion, the 3D model of GBM angiogenesis assay developed in this work is effective in studying the effect of molecules with therapeutic potential on endothelial cells and the tested hybrid protein Sema-PSI-Ig-HBD exerts a modulating activity on GBM and endothelial cells spatial organization.