Šakotos grandinės aminorūgščių įtaka navikinių ląstelių metabolizmui
Recenzentas / Reviewer |
Šakotos grandinės aminorūgštys (BCAA) yra būtinos žmogaus organizmui ir turi reikšmingos įtakos navikų metabolizmui. Ankstesni tyrimai Lietuvos sveikatos mokslų universitete parodė, kad MCF-7 krūties naviko ląstelėse yra pernelyg išreikšta šakotos grandinės aminorūgščių transferazė 2 (BCAT2). Tai rodo, jog šis fermentas turi daugiau įtakos naviko, nei sveikų ląstelių metabolizmui. Bioinformacinės analizės metu prognozuota, kad MCF-7 didžiąją dalį savo energijos gauna skaidydamos BCAA, taigi galima daryti prielaidą, kad BCAT2 nutildymas sutrikdytų navikinių ląstelių energijos ciklą. Šio tyrimo metu keliais būdais buvo slopintas BCAT2 ir buvo siekiama išsiaiškinti, kokį vaidmenį šis fermentas turi navikinių ląstelių proliferacijai, kolonijų formavimuisi, gyvybingumui ir mitochondrijų membranų potencialui (m). Norint baltymo funkcijos ištyrimą atlikti kuo tiksliau, buvo pradėta nuo siRNR prieš BCAT2 transfekcijos. Tyrimui naudotos MCF-7, MCF-10A, BCC, HeLa ir HCT116 ląstelių linijos. Gyvybingumui ir mitochondrijų membranos potencialo nustatymui naudoti 7-AAD (7-aminoaktinomicinas D) ir JC-1 fluorescentiniai dažai. Ląstelių transfekcija su siRNR prieš BCAT2 neturėjo didelės įtakos MCF-7, MCF-10A, BCC, HeLa bei HCT116 ląstelių proliferacijai, gyvybingumui ir kolonijų formavimuisi. Priešingi rezultatai gauti su mitochondrijų membranos potencialu – pastebėta hiperpoliarizacija, t.y. mitochondrijos tapo labai aktyvios, dėl galimai įsijungusių kompensacinių mechanizmų, sutrikdžius BCAA metabolizmą. Tinkamam slopikliui BCAT2 rasti buvo naudotos kompiuterinės vaistų dizaino programos. Protein Data Bank duomenų bazėje rastas ligandas pavadinimu EL2 (PDB ID: 5HNE), kuris jau buvo žinomas dėl savo slopinančio poveikio BCAT2, todėl kaip šablonas panaudotas svarbiausias baltymo ir ligando sąveikos struktūrinis komponentas – benzimidazolo žiedas. Naudojantis vaistų panašumo filtrais, buvo patikrinti keli komerciškai prieinami benzimidazolo žiedą turintys junginiai ir, siekiant išsiaiškinti geriausią kandidatą į vaistą, dokinimui naudota QuickVina-W programa. Buvo nustatytas potencialus kandidatas – 2-(4-(2-(1-pirolidinil)etoksi)fenil)-1H-benzimidazolas (2FBI-1). Su nauju 2FBI-1 junginiu pakartota tėkmės citometrija. Šį kartą proliferacija ir gyvybingumas mažėjo priklausomai nuo naudotos junginio koncentracijos, kaip ir stiprėjanti mitochondrijų hiperpoliarizacija bei reikšmingai sumažėjęs navikinių ląstelių kolonijų skaičius ir užimamas plotas. Silpnesnis poveikis pastebėtas sveikų MCF-10A ląstelių linijoje. Apibendrinant, mitochondrijų membranos potencialo didėjimas vyko tiek naudojant specifinę siRNR, tiek naująjį junginį, galima daryti prielaida, kad 2FBI-1 yra efektyvus BCAT2 slopiklis. BCAT2 yra atsakingas už normalų navikinių ląstelių dauginimąsi, gyvybingumą, mitochondrijų membranos potencialą ir kolonijų susidarymą.
Branched-chained amino acids (BCAAs) are essential for humans and it seems they play a big role in cancer metabolism. Previous studies in Lithuanian University of Health Sciences showed an overexpression of branched-chained amino acid transferase 2 (BCAT2) in MCF-7 breast cancer cells. That indicates that BCAAs are of greater importance to tumour cells. Bioinformatic analysis predicted MCF-7 gets most of its energy from breaking down BCAAs. This suggested silencing BCAT2 to disrupt the energy cycle of tumour cells. BCAT2 was silenced in several ways during this study and flow cytometry was used to find out the role this enzyme plays in cancer cell proliferation, viability, mitochondrial membrane potential and colony formation. Small interfering RNA (siRNA) transfection against BCAT2 gene was used for more precise examination of the enzyme. MCF-7, MCF-10A, BCC, HeLa and HCT116 cell lines were used as tumour models. 7-AAD and JC-1 fluorescent dyes were used for viability and mitochondrial membrane potential determination respectively. BCAT2 transfection had slight effect on proliferation, viability and colony formation of MCF-7, MCF-10A, BCC, HeLa and HCT116 cells. In case of mitochondrial membrane potential hyperpolarisation was observed, meaning mitochondria became highly active, due to compensation of impaired BCAA metabolism. Computational drug design was used to find a molecule, that would inhibit BCAT2 effectively. A ligand named EL2 was found on Protein Data Bank (PDB ID: 5HNE) that was already known for its inhibitory effect on BCAT2, so the most important structural component of the protein-ligand interaction – the benzimidazole ring, was used as a template. A few commercially available compounds were screened through a number of drug-likeness filters and the best drug candidate was identified by docking using QuickVina-W and the result was 2-(4-(2-(1pyrrolidinyl)ethoxy)phenyl)-1H-benzimidazole (2FBI-1). The new compound was tested, and the result was significant concentration-dependent drop of proliferation and viability, highly hyperpolarised mitochondria and a decrease in cancer cell colony count and area occupied in the well. A weaker effect was observed in the normal MCF-10A cell line. To conclude, the same spike in mitochondria membrane potential occured using both specific siRNA and the new compound, 2FBI-1 can be an effective BCAT2 inhibitor. To some extent BCAT2 is responsible for cancer cell proliferation, viability, mitochondrial membrane potential and colony formation.