Šakotos grandinės aminorūgščių metabolizmo įtaka navikinių ląstelių funkcijoms
Dogelytė, Roberta |
Navickas, Matas |
Bakalauro baigiamojo darbo autorius: Dogelytė R.
Tema: Šakotos grandinės aminorūgščių metabolizmo įtaka navikinių ląstelių funkcijoms.
Mokslinis vadovas: dr. Valeryia Mikalayeva
Atlikimo vieta: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Kardiologijos institutas, Ląstelių kultūrų laboratorija. Santraukos turinys:
Šakotos grandinės aminorūgštys (BCAA), įskaitant leuciną, izoleuciną ir valiną, yra nepakeičiamos aminorūgštys, kurios atlieka gyvybiškai svarbų vaidmenį baltymų sintezėje ir energijos gamyboje. Navikinėms ląstelėms jos gali būti gaunamos iš naviko mikroaplinkos arba skaidant baltymus. BCAA metaboliniai fermentai, tokie kaip citozolinė šakotos grandinės aminorūgščių transferazė 1 (BCAT1) ir mitochondrinė šakotos grandinės aminorūgščių transferazė 2 (BCAT2), yra naudingi naviko žymenys. Taigi šio darbo metu buvo analizuojama, kaip BCAT2 geno nutildymas gali sutrikdyti navikinių ląstelių energijos ciklą. Taip pat tyrimo tikslas buvo išsiaiškinti kokią įtaka turėjo navikinių ląstelių gyvybingumui, mitochondrijų membranos potencialui ir baltymų raiškai BCAT2 geno slopinimas. Tyrimams buvo pasirinktos dvi krūties naviko ląstelių linijos – MCF-7 ir BCC, kurios buvo auginamos įprastoje ir skirtingose sumažintos koncentracijos šakotos grandinės aminorūgščių terpėse, su pridėtu 3-metil-2-oksobutano rūgšties (MOB) BCAA skaidymo kelio metabolitu. Ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas ląsteles nudažius aneksinu V ir 7-aminoaktinomicinu D (7-AAD), o mitochondrijų membranų potencialo tyrimai buvo atlikti naudojant 5,5'6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'- tetraetilbenzimidazololkarbocianino jodido (JC-1) dažą. Šie rezultatai gauti panaudojant tėkmės citometriją. BCAT2 baltymo raiška buvo keičiama transfekcijos metodu, nutildymui naudojant siRNR prieš BCAT2 geną. BCAT2 baltymo kiekis nustatytas imunoblotingo metodu. Gauti rezultatai rodo, kad BCAA metabolizmas turi didelės įtakos navikinių ląstelių gyvybingumui. Taip pat atliktų tyrimų metu buvo vertinamas metabolito MOB poveikis ląstelėms. Gauti rezultatai parodė, kad šakotos grandinės aminorūgštys turi didelės reikšmės ląstelių gyvybingumui, nes ląstelių augintų sumažintos koncentracijos 0,4 mM BCAA terpėje, tiek transfekuotų siRNR prieš BCAT2, tiek papildytoje metabolitu – MOB, gyvybingumas buvo ženkliai didesnis lyginant su kitose terpėse augintomis ląstelėmis.
Taip pat šioje terpėje ankstyvos ir vėlyvos apoptozės stadijos ląstelių kiekis buvo ženkliai mažesnis, lyginant su kitomis sąlygomis augintomis ląstelėmis. Atlikti tyrimai, kurių metu stebimi navikinių ląstelių mitochondrijų membranos potencialo pokyčiai augintų skirtingose terpėse, taip pat ląstelių atsakas į MOB poveikį ar BCAT2 baltymo raiškos pokyčius. Rezultatai parodė, kad didžiausias Δψm matomas BCC ląstelėse po nutildymo siRNR prieš BCAT2 geną, kai terpė papildyta MOB. MCF-7 ląstelių linijoje Δψm labiausiai padidėjo po BCAT2 geno nutildymo 0,4 mM BCAA terpėje. BCAT2 baltymo raiškos pakitimai buvo vertinami, panaudojus siRNR nutildymą prieš BCAT2 skirtingose auginimo terpėse bei su MOB priedu. Išanalizavus gautus duomenis, stebima didelė BCAT2 baltymo raiška BCC ląstelių linijoje. MOB priedas įprastoje DMEM/F12 terpėje augintose MCF-7 ląstelėse padidina BCAT2 baltymo raišką net po nutildymo. Po nutildymo su siRNR, BCAT2 raiška abiejų ląstelių linijose sumažėja, tačiau pridėjus į terpę su transfekuotomis ląstelėmis MOB, baltymo kiekis dalinai atsistato.
Author of bachelor thesis: Dogelytė R. Title: The impact of branched-chain amino acid metabolism on tumour cell function. Work was performed at: Lithuanian University of Health Sciences; Faculty of Medicine; Laboratory of Cell Culture of Institute of Cardiology – Kaunas. Summary: Branched-chain amino acids (BCAAs), including leucine, isoleucine and valine, are essential amino acids that play a vital role in protein synthesis and energy production. For tumour cells, they can be obtained from the tumour microenvironment or by protein degradation. BCAA metabolic enzymes such as cytosolic branched chain amino acid transferase 1 (BCAT1) and mitochondrial branched chain amino acid transferase 2 (BCAT2) are useful tumour markers. Thus, the present work analysed how silencing of the BCAT2 gene can disrupt the energy cycle of tumour cells. The aim of the study was also to investigate the effect of BCAT2 gene silencing on tumour cell viability, mitochondrial membrane potential and protein expression Two breast tumour cell lines, MCF-7 and BCC, were selected for the study and grown in normal and different reduced concentration branched chain amino acid media with the addition of the BCAA degradation pathway metabolite 3-methyl-2-oxobutyric acid (MOB). Cell viability was measured by staining the cells with Annexin V and 7-aminoactinomycin D (7-AAD), and mitochondrial membrane potential assays were carried out using the 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3,3'-tetraethylbenzimidazole- carbocyanine iodide (JC-1) stain. These results were obtained using flow cytometry. The expression of the BCAT2 protein was altered by transfection using siRNA against the BCAT2 gene for silencing. BCAT2 protein levels were determined by immunoblotting. The results show that BCAA metabolism has a significant impact on tumour cell viability. The effect of the metabolite MOB on the cells was also evaluated in the present studies. The results showed that branched-chain amino acids are important for cell viability, as the viability of cells grown in reduced concentrations of 0.4 mM BCAA medium, both transfected with siRNA against BCAT2 and supplemented with the metabolite MOB, was significantly higher compared to cells grown in other media. The number of early and late apoptotic cells was also significantly lower in this medium compared to cells cultured under other conditions. Studies have been carried out to observe changes in the mitochondrial membrane potential of tumour cells grown in different media, as well as the cellular response to MOB exposure or changes in BCAT2 protein expression. The results showed that the highest Δψm was observed in BCC cells after silencing with siRNA against the BCAT2 when the medium was supplemented with MOB. In the MCF-7 cell line, Δψm increased the most after silencing the BCAT2 gene in 0.4 mM BCAA medium. The changes in BCAT2 protein expression were evaluated using siRNA silencing against the BCAT2 in different growth media and with MOB supplementation. The analysis of the data showed a high expression of BCAT2 protein in the BCC cell line. The addition of MOB in MCF-7 cells grown in normal DMEM/F12 medium increases BCAT2 protein expression even after silencing. After silencing with siRNA, the expression of BCAT2 protein is reduced in both cell lines, however the addition of MOB to the medium with transfected cells partially restores the protein level.