Kavos rūgšties fenetilo esterio poveikio vėžinių ląstelių gyvybingumui ir mitochondrijų funkcijoms tyrimas

Darbo tikslas: Ištirti kavos rūgšties fenetilo esterio poveikį inkstų vėžinių (CAKI-2) ir sveikų (RPTEC/TERT1) ląstelių proliferacijai, gyvybingumui ir mitochondrijų funkcijoms.. Darbo uždaviniai: Ištirti kavos rūgšties fenetilo esterio poveikį žmogaus inkstų (sveikų ir vėžinių ląstelių linijų) proliferacijai ir gyvybingumui, įvertinti mitochondrijų kvėpavimo greitį žmogaus inkstų sveikose ir vėžinėse ląstelėse, jas paveikus skirtingų koncentracijų kavos rūgšties fenetilo esteriu, nustatyti tiriamosios medžiagos poveikį ląstelių žūčiai. Tyrimo objektas: Tyrimai buvo atliekami su sveikų žmogaus inkstų proksimalinių kanalėlių epitelinių ląstelių imortalizuota linija RPTEC/TERT1 ir su vėžinėmis žmogaus inkstų proksimalinių kanalėlių epitelinėmis ląstelėmis CAKI-2. Metodika: Tiriamos ląstelių kultūros buvo veikiamos skirtingomis kavos rūgšties fenetilo esterio koncentracijomis (0,25, 0,5, 1, 2, 4, 9, 17, 35 μM) 24 val (37°C temperatūroje). Po inkubacijos, ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas spektrofotometrijos metodu, naudojant „Presto blue TM”, vertinant šviesos spindulio intensyvumą bei fluorescencijos metodu įvertinant ląstelių žūtį. Ląstelių energetikai įvertinti, ląstelių linijos buvo 24 val. veikiamos (37°C tempetratūroje) kavos rūgšties fenetilo esteriu. Po inkubacijos, naudojant oksigrafą Oxygraph-2k registravome tiriamųjų ląstelių linijų mitochondrijų kvėpavimo greičius skirtingose metabolinėse būsenose. Rezultatai: Nustatyta, jog ląstelių gyvybingumas mažėjo didėjant kavos rūgšties fenetilo koncentracijai. Nustatytos CAPE koncentracijos - IC50 = 3 μM RPTEC/TERT1 ir IC50 = 7 μM CAKI- 2 (vėžinėms) ląstelių linijoms. Nustatyta, kad CAPE sukėlė ląstelių nekrozę abiejose ląstelių linijose. Mitochondrijų energetiką fosforilinimo būsenoje (substratas glutamatas/malatas) CAPE slopino 80 proc. RPTEC/TERT1 ir 52 proc. vėžinėse CAKI-2 ląstelėse. Oksiduojant II mitochondrijų kvėpavimo komplekso subtratą sukcinatą, kvėpavimo greitis, paveiktose CAPE ląstelių grupėse, sumažėjo atitinkamai 75 proc. ir 36 proc. Vidinė mitochondrijų membrana, ląsteles paveikus CAPE, nebuvo pažeista. Vertinant kvėpavimo kontrolės koeficientus oksiduojant I mitochondrijų kvėpavimo komplekso substratus, pastebėta, jog koeficientai sumažėjo abejose grupėse, tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo, tačiau oksiduojant II mitochondrijų kvėpavimo komplekso subtratus, šis koeficientas statistiškai reikšmingai sumažėjo paveiktoje CAPE CAKI-2 ląstelių grupėje (51 proc.).. Statistiškai reikšmingas citochromo c efekto padidėjimas pastebėtas paveiktoje CAPE CAKI-2 ląstelių grupėje, šis koeficientas padidėjo 53 proc. CAPE, priklausomai nuo koncentracijos, slopino ląstelių proliferaciją ir sukėlė nekrozę. Išvados: Tyrimo metu nustatyta, jog kavos rūgšties fenetilo esteris turi neigiamą poveikį ląstelių gyvybingumui ir proliferacijai ir sukelia ląstelių nekrozę žmogaus inkstų sveikose (RPTEC/TERT1) ir vėžinėse (CAKI-2) ląstelėse. Kavos rūgšties fenetilo esteris slopina žmogaus inkstų sveikų ir vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greitį visose metabolinėse būsenose, oksiduojant glutamatą/malatą ir sukcinatą, ir padidina mitochondrijų išorinės membranos pralaidumą CAKI-2 ląstelėse.

The aim of the study: To investigate the effects of caffeic acid phenethyl ester on the viability, and mitochondrial function of kidney cancer (CAKI-2) and healthy (RPTEC/TERT1 ) cells. The tasks of the study: To investigate the effect of caffeic acid phenethyl ester on the proliferation and viability of human kidney (healthy and cancer cell lines), to assess the rate of mitochondrial respiration in human kidney healthy and cancer cells when exposed to different concentrations of caffeic acid phenethyl ester, and to determine the effect of the test substance on cell death. The object of the study: The studies were performed on the immortalised human renal proximal tubular epithelial cell line RPTEC/TERT1 and the cancerous human renal proximal tubular epithelial cell line CAKI-2. Methods: The cell cultures were treated with different concentrations of caffeic acid phenethyl ester (0,25, 0,5, 1, 2, 4, 9, 17, 35 μM) for 24 h (37°C). After incubation, cell viability was assessed by spectrophotometry using Presto blue TM to assess light intensity and fluorescence to assess cell death. To assess cell energetics, cell lines were treated for 24 h (37°C) with caffeic acid phenethyl ester. After incubation, we recorded the mitochondrial respiration rates of the cell lines in different metabolic states using an Oxygraph-2k. Results: Cell viability was found to decrease with increasing concentrations of caffeic acid phenethyl. The optimal concentrations of CAPE were IC50 = 3 μM for healthy and IC50 = 7 μM for cancer cell lines. High concentrations of CAPE caused cell necrosis. Mitochondrial energetics in the phosphorylation state were inhibited by CAPE by 80% in healthy and 52% in cancer cells (substrate glutamate/malate). Oxidation of succinate, a substrate of mitochondrial respiratory complex II, resulted in a 75% and 36% reduction in respiration rate in CAPE-treated cell groups, respectively. The respiratory control index showed a decrease in coefficients in both groups with glutamate/malate as substrate in CAPE-treated group, but no statistically significant difference, whereas with succinate ( complex II dependent substrate) it decreased statistically significant by 51%. A statistically significant effect of cytochrome c was observed in the treated CAPE CAKI-2 cell group, with a 53% increase in this cytochrome c effect. Conclusions: The study found that the phenethyl ester of caffeic acid has a negative effect on cell viability and proliferation and causes cell necrosis in human kidney healthy (RPTEC/TERT1) and cancer (CAKI-2) cells. Caffeic acid phenethyl ester inhibits the respiration rate of mitochondria in human kidney healthy and cancer cells with both substrates, glutamate/malate and succinate, in all metabolic states and increases outer mitochondrial membrane permeability in CAKI-2 cells.