Navikinių ląstelių migraciją reguliuojantys molekuliniai mechanizmai
Mikalayeva, Valeriyia |
Urbonavičiūtė, Rūta |
Santraukos turinys: Svarbiausias navikų vystymosi ir metastazių tyrimų tikslas suprasti, kaip yra reguliuojama ląstelių migracija 3D ekstraląstelinėje matricoje (ECM) metastazių metu, kai navikinės ląstelės migruoja iš pirminio naviko vietos į aplinkinius audinius ir organus. Šio tyrimo tikslas buvo išsiaiškinti, kaip ARHGAP29 geno ekspresijos pokyčiai, aktyvuojant RhoA, paveiks trigubai neigiamo krūties naviko MDA-MB-231 ląstelių aktino citoskeleto struktūrą, židininio sukibimo su substratu vietas bei ląstelių migraciją. Panaudojant vektorių, mes sukūrėme krūties naviko MDA-MB-231 ląstelių linijas su nutildytu (angl. kock down) ARHGAP29 baltymu ir palyginome šių baltymų ekspresijos pokyčius baltymų imunoblotingo metodu su kontrolinės bei ARHGAP29 KO (angl. knock out) ląstelių linijomis. ARHGAP29 KD ir KO linijose imunocitocheminiu ląstelių dažymo metodu buvo įvertinta ląstelių aktino citoskeleto organizacijos pokyčiai bei židininio sukibimo vietų skaičius ir dydis. Taip pat naudojant time-lapse metodą buvo atlikta ląstelių migracijos analizė, kurios metu buvo įvertintas ląstelių judėjimo greitis, nueitas atstumas, kelio ilgis bei judėjimo kryptingumas. Tyrimo rezultatai parodė, jog po ARHGAP29 geno nutildymo ar išveiklinimo trigubai neigiamo krūties naviko MDA-MB-231 ląstelių migracija buvo sumažėjusi. Tai galima paaiškinti padidėjusiu RhoA aktyvumu, kuris skatino aktino gijų polimerizaciją ties ląstelės kraštu bei židininio sukibimo vietų brendimą, kas lėmė mažesnį ląstelių mobilumą. Taip pat atlikus pavienių ląstelių judėjimo sekimo analizę, paaiškėjo, jog slopinama ARHGAP29 baltymo ekspresija buvo susijusi su sumažėjusiu ląstelių judėjimo greičiu, nueitu atstumu bei kelio ilgiu. Mūsų rezultatai rodo, kad ARHGAP29 yra svarbus veiksnys trigubai neigiamo krūties naviko MDA-MB-231 ląstelių migracijoje, o šio baltymo raiškos slopinimas lemia mažesnį šių ląstelių mobilumą. TNBC migraciją reguliuojančių mechanizmų supratimas suteiks naujų įžvalgų apie mechanizmus, reguliuojančius TNBC ląstelių metastazes, ir padės rasti naujų vaistų taikinių bei gydymo būdų.
Summary: A major goal of tumour development and metastasis research is to understand how cell migration in the 3D extracellular matrix (ECM) is regulated during metastasis, when tumour cells migrate from the primary tumour site to surrounding tissues and organs. The aim of this study was to investigate how changes in ARHGAP29 gene expression upon RhoA activation would affect the actin cytoskeleton structure, focal adhesion sites to the substrate, and cell migration of triple negative breast tumour MDA-MB-231 cells. Using lentiviral vectors we generated breast tumour MDA-MB-231 cell lines with silenced (knock down) ARHGAP29 protein and compared the changes in the expression of these proteins by protein immunoblotting with control and ARHGAP29 KO cell lines. Changes in cellular actin cytoskeletal organisation and the number and size of focal adhesion sites in ARHGAP29 KD and KO lines were assessed by immunocytochemical cell staining. Cell migration analysis was also performed using a time-lapse approach to assess the speed of cell movement, the distance travelled, the length of the path and the directionality of movement. The results showed that MDA-MB-231 triple-negative breast tumour MDA-MB-231 had reduced cell migration after ARHGAP29 gene silencing or inactivation. This could be explained by increased RhoA activity, which promoted polymerisation of actin filaments at the cell edge and maturation of focal adhesion sites, leading to reduced cell mobility. In addition, single cell movement tracking analysis showed that inhibited expression of ARHGAP29 protein was associated with reduced cell movement speed, distance travelled and path length. Our results suggest that ARHGAP29 is an important factor in the migration of MDA-MB-231 triple-negative breast tumour cells, and that inhibition of ARHGAP29 expression results in reduced cell mobility. Understanding the mechanisms regulating TNBC migration will provide new insights into the mechanisms regulating TNBC cell metastasis and will lead to new drug targets and therapies.