Mitochondrijų nespecifinio laidumo poros reguliacijos išemijos metu tyrimas

Darbo tikslas: Ištirti mitochondrijų nespecifinio laidumo reguliavimo molekulinį mechanizmą pirminėse grynose astrocitų ląstelių kultūrose. Darbo uždaviniai:

1. Įvertinti ląstelių gyvybingumą pirminėse grynose astrocitų ląstelių kultūrose normoksijos, hipoksijos ir simuliuotos išemijos in vitro sąlygomis.
2. Įvertinti mitochondrijų nespecifinį laidumą pirminėse grynose astrocitų ląstelių kultūrose normoksijos ir hipoksijos sąlygomis.
3. Įvertinti vandenilio peroksido susidarymą pirminėse grynose astrocitų ląstelių kultūrose. Tyrimo objektas: eksperimentinių tyrimų atlikimui buvo naudojama pirminė gryna astrocitų ląstelių kultūra, išskirta iš mišrios astroglijos ląstelių kultūros. Metodai: Ląstelių skaičius ir gyvybingumas pirminėse grynose astrocitų ląstelių kultūrose vertinamas fluorescencinės mikroskopijos principu naudojant bisbensimido (Hoechst 33342) ir propidžio jodido dažus. Mitochondrijų nespecifinis laidumas pirminėse grynose astrocitų ląstelių kultūrose vertinamas fluorescencinės mikroskopijos principu naudojant Calcein AM/Co2+ metodą. Aktyvių deguonies junginių susidarymas pirminėse grynose astrocitų ląstelių kultūrose vertinamas fluorimetriniu analizės metodu, naudojant komercinį Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit rinkinį. Rezultatai: 24 val. trukmės simuliuota išemija in vitro, kuomet yra deguonies ir energinių substratų trūkumas, sukėlė apoptozinę astrocitų ląstelių žūtį, o hipoksijai ląstelės buvo atsparios. Mitochondrijų nespecifinis laidumas pirminėse grynose astrocitų ląstelių kultūrose nesiskyrė nei normoksijos, nei hipoksijos, nei simuliuotos išemijos in vitro sąlygomis. Ciklosporinas A ir imegliminas poveikio reguliuoti mitochondrijų nespecifinį laidumą astrocitų ląstelėse neturėjo. Vandenilio peroksido susidarymo greitis pirminėje grynoje astrocitų ląstelių kultūroje normoksijos, hipoksijos ir simuliuotos išemijos in vitro modeliuose nesiskyrė. Išvados: Deguonies ir energinių substratų stoka sukelia astrocitų ląstelių žūtį, o esant tik deguonies trūkumui, kai yra pakankamai energinių substratų, ląstelės yra atsparios hipoksijos sąlygotoms pažaidoms.

The aim of the investigation: To investigate the molecular mechanism of mitochondrial permeability transition pore regulation in primary astrocyte cultures. Objectives:

1. To evaluate cell viability in primary astrocyte cultures under normoxic, hypoxic and simulated ischemia in vitro conditions.
2. To assess mitochondrial permeability transition in primary astrocyte cultures under normoxic and hypoxic conditions.
3. To evaluate the formation of hydrogen peroxide in primary astrocyte cultures. The object of the investigation: A primary cell cultures of astrocytes prepared from mixed astroglial cultures were used in the research. Methods: The quantity and cell viability of primary astrocyte cultures were evaluated using bisbenzimide (Hoechst 33342) and propidium iodide dyes. The mitochondrial permeability transition in primary astrocyte cultures was assessed by fluorescence microscopy using Calcein AM/Co2+ method. The formation of hydrogen peroxide in primary astrocyte cultures was assessed by fluorometric analysis using commercial Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase assay kit. Results: Simulated ischemia in vitro for 24 hours in the absence of oxygen and energetic substrates induced apoptotic cell death of astrocytes, while cells were resistant to hypoxia only. The opening of mitochondrial permeability transition pore in primary astrocytes cultures did not differ under normoxic, hypoxic or simulated ischemia in vitro conditions. Cyclosporine A and imeglimine had no effect on mitochondrial permeability transition of astrocytes. The rate of hydrogen peroxide generation in primary astrocytes cultures did not differ under normoxic, hypoxic and simulated ischemia in vitro conditions. Conclusions: A lack of oxygen and energetic substrates causes apoptotic astrocytes’ death, while in the absence of oxygen only, when there is sufficient amount of energetic substrates, astrocytes are resistant.