Daugiaparametrinis PBMC T-ląstelių tyrimas greitam sukonstruotų bococizumabo variantų imunogeniškumo įvertinimui
Pažėraitis, Deividas |
Recenzentas / Reviewer |
Pagrindas Imunogeniškumas – dažniausiai pasireiškiantis prieš vaistą nukreiptų antikūnų (ADA) susidarymu – išlieka viena pagrindinių terapinių antikūnų veiksmingumo praradimo ir dozę ribojančio toksiškumo priežasčių. Monokloninis anti-PCSK9 antikūnas bococizumabas buvo nutrauktas III fazėje, kai > 40 % pacientų susiformavo neutralizuojantys ADA. Kadangi ADA indukcija daugiausia priklauso nuo CD4⁺ T limfocitų, žmogaus periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių (PBMC) testai vis plačiau taikomi in vitro rizikai prognozuoti ir baltymų inžinerijai nukreipti. Tikslas Patvirtinti greitą PBMC CD4⁺ T ląstelių testą, kuriame ląstelių proliferacija, vertinama naudojant CFSE dažą, derinama su aktyvacijos žymenų analize, kaip klinikinio imunogeniškumo prognozavimo priemone. Pritaikyti testą penkiems bococizumabo variantams, sukurtiems „Mammalian Display“ metodu, siekiant atrinkti variant, turintį mažiausią imunogenišką. Metodai PBMC iš dešimties sveikų donorų, turinčių skirtingus HLA lokusus, aštuonias paras buvo stimuliuojami: (i) licencijuotų antikūnų etaloniniu rinkiniu, apimančiu mažą, vidutinį ir didelį klinikinį ADA dažnį, (ii) tėviniu bococizumabu ir (iii) penkiais sekos inžineriniais variantais, pasižyminčiais mažesne agregacija ir polireaktyvumu. CD4⁺ T-ląstelių atsakai kiekybiškai vertinti pagal CFSE skiedimą ir keturių paviršinių aktyvacijos žymenų (CD69, CD25, CD71, CD40L) raišką 5-ąją parą. Kiekvienam antikūnui apskaičiuotas stimuliacijos indeksas (SI); donorai, kurių SI ≥ 2,0 (p < 0,05), laikyti atsakančiais. Sudėtinis atsako indeksas (RI = % atsakančių × vidutinis SI) naudotas imunogeniškumui reitinguoti. Rezultatai Sukurta PBMC CD4+ T ląstelių platforma parodė, kad didelės ADA rizikos etaloniniai antikūnai indukavo CD4⁺ T-ląstelių atsaką reikšmingai didesniam donorų skaičiui ir sukėlė aukštesnes SI reikšmes, nei žemos ADA rizikos preparatai. Gautas RI reitingas atitiko publikuotus klinikinius duomenis. Tėvinis bococizumabas turėjo vieną aukščiausių RI, patvirtindamas savo imunogeniškumo problemą. Priešingai, keli inžineriniai variantai rodė ryškų rizikos sumažėjimą: du klonai (EEH, NEI) pateko į tą patį RI intervalą kaip ir bevacizumabas, trastuzumabas ir alirokumabas (≤ žemas klinikinis ADA). Aktyvacijos žymenų profiliai patvirtino proliferacijos duomenis, o sumažėjęs imunogeniškumas koreliavo su pagerintomis biofizinėmis savybėmis. Išvados Optimizuotas PBMC testas tiksliai suskirstė rinkoje esančius antikūnus pagal realų ADA dažnį ir diskriminavo artimus bococizumabo variantus; iš jų buvo nustatyti du mažos rizikos kandidatai. Rezultatai rodo, kad ankstyva greitųjų žmogaus PBMC testų integracija su ankstyvų žymenų detekcija leidžia identifikuoti imunogeniškumą ir galėtų paspartinti saugesnių biologinių vaistų kandidatų atranką.
Background Immunogenicity—most commonly the formation of anti-drug antibodies (ADAs)—remains a leading cause of loss of efficacy and dose-limiting toxicity for therapeutic antibodies. Bococizumab, an anti-PCSK9 monoclonal antibody, was terminated in Phase III after >40 % of patients developed neutralising ADAs. Because ADA generation is largely CD4⁺ T-cell dependent, human peripheral-blood mononuclear-cell (PBMC) assays are increasingly used to predict risk in vitro and to guide protein engineering. Aim To qualify a rapid PBMC CD4⁺ T-cell assay—combining CFSE proliferation and activation-marker read-outs—as a predictive screen for clinical immunogenicity, and to apply it to five mammalian-display variants of bococizumab in order to select the least immunogenic lead. Methods PBMCs from ten HLA-diverse healthy donors were stimulated for eight days with (i) a reference panel of licensed antibodies spanning low-, moderate- and high-ADA incidence, (ii) parental bococizumab, and (iii) five sequence-engineered variants possessing reduced aggregation and poly-reactivity. CD4⁺ T-cell responses were quantified by CFSE dilution, four surface activation markers (CD69, CD25, CD71, CD40L) on day 5. For each antibody a stimulation index (SI) was calculated; donors with SI ≥ 2.0 (P < 0.05) were designated responders. A composite Response Index (RI = % responders × mean SI) was used to rank immunogenicity. Results High-ADA reference antibodies elicited significantly higher responder frequencies and SI values than low-ADA controls, producing an RI ranking that mirrored published clinical data. Parental bococizumab recorded one of the highest RI scores, consistent with its known liability. In contrast, several engineered variants showed marked risk attenuation: two clones (EEH, NEI) fell within the RI range of bevacizumab, trastuzumab and alirocumab (≤ low clinical ADA), activation-marker profiles corroborated the proliferation data, and reduced immunogenicity correlated with improved biophysical properties. Conclusions The optimized PBMC assay accurately stratified marketed antibodies by their actual ADA incidence and discriminated closely related bococizumab variants, identifying two low-risk candidates among them. The results indicate that early integration of rapid human PBMC assays with early marker detection makes it possible to identify immunogenicity and could accelerate the selection of safer biological drug candidates.