Žarnyno organoido epigenetinio stabilumo vertinimas
Gasiūnienė, Monika |
Bakalauro baigiamojo darbo autorius: Kirilevičiūtė I. Tema: Žarnyno organoido epigenetinio stabilumo vertinimas Mokslinis vadovas: dr. Rūta Steponaitienė Atlikimo vieta: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Virškinimo sistemos tyrimų institutas, Klinikinės ir molekulinės gastroenterologijos laboratorija Santraukos turinys: Opinis kolitas (OpK) yra lėtinė, progresuojanti imuninės kilmės uždegiminė žarnyno liga. Šios ligos etiopatogenezei yra labai svarbūs genetiniai, epigenetiniai, mikrobiologiniai bei aplinkos veiksniai. Siekiant geriau suprasti šią ligą sąlygojančius veiksnius ir procesus yra kuriamos 3D organoidų modelinės sistemos. Šio darbo tikslas buvo įvertinti organoidų, sugeneruotų iš sergančių opiniu kolitu ir sveikų asmenų storosios žarnos kamieninių ląstelių, epigenetinį stabilumą. Iškeltiems uždaviniams įvykdyti buvo kultivuojamos bei charakterizuojamos organoidų kultūros, išskiriama DNR iš kriptų mėginių, biopsijų bei organoidų kultūrų. Atliktas DNR kiekio ir kokybės įvertinimas, išskirtos DNR bisulfitinė modifikacija. Buvo vykdomas bisulfitu modifikuotos DNR pagausinimas PGR, naudojant biotinu žymėtus LINE-1 pradmenis, taip pat gautų PGR produktų dydžio ir kokybės įvertinimas agarozės gelyje. Atliktas biotinu žymėtų PGR produktų sugaudymas streptavidino sefarozės dalelėmis, pagausintų mėginių paruošimas pirosekoskaitai bei LINE-1 CpG salų metilinimo kiekybinis nustatymas. Gauti rezultatai parodė, kad išauginti organoidai pasižymėjo epitelio poliškumu, formavo glaudžiąsias jungtis, buvo aptiktos proliferuojančios ląstelės ir nedidelė dalis specializuotų žarnyno ląstelių, t. y. kolonocitų, gobleto ląstelių, enteroendokrininių ląstelių. Atlikta statistinė analizė, remiantis Mann-Whitney U-testo statistiniu palyginimu, parodė, kad kontrolinėje grupėje tirtojo LINE-1 regiono CpG salų metilinimo lygis išlieka nepakitęs, t. y. skirtumai yra statistiškai nepatikimi (p > 0,05 visoje modelinėje sistemoje). Opinio kolito remisijos grupėje nustatyti keli statistiškai reikšmingi skirtumai tarp biologinės medžiagos mėginių: biopsija vs. organoidai P0 p = 0,013, biopsija vs. organoidai P1 p = 0,0024, biopsija vs. organoidai P5 p = 0,016, ir kriptos vs. organoidai P1 p = 0,018. Aktyvaus opinio kolito grupėje statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas tik lyginant biopsiją vs. organoidus P1 (p = 0,023). Gauti rezultatai leido daryti išvadas, kad kontrolinė storosios žarnos 3D organoido modelinė sistema lyginant su pirminiu jos šaltiniu (t. y. biopsijos mėginiu), pasižymi stabiliu DNR metilinimo lygiu, o opinio kolito grupėse stebimi statistiškai reikšmingi skirtumai. Palyginus LINE-1 metilinimo lygį tarp skirtingų organoidų persėjimų, nustatyta, jog statistiškai patikimų skirtumų nei vienoje grupėje nėra, todėl organoidų kultūra išlieka epigenetiškai stabili viso ilgalaikio kultivavimo metu. Taip pat statistinė analizė atskleidė, kad atlikto tyrimo tiriamųjų imtyje LINE-1 metilinimo lygis nėra ligai specifinis ir jis statistiškai nesiskiria lyginant kontrolinę ir sergančiųjų grupes visuose biologinės medžiagos taškuose, išskyrus storosios žarnos organoidų kultūrą po pirmo persėjimo (P1).
Author of bachelor thesis: Kirilevičiūtė I.
Title: Evaluation of epigenetic stability of the intestinal organoid.
Work was performed at: Lithuanian University of Health Sciences; Faculty of Medicine, Institute for Digestive Research, Laboratory of Clinical and Molecular Gastroenterology Summary: Ulcerative colitis (UC) is a chronic, progressive inflammatory bowel disease of immune origin. Genetic, epigenetic, microbiological and environmental factors are very important for the etiopathogenesis of this disease. In order to better understand the factors and processes leading to this disease, 3D organoid model systems are being developed. The aim of this work was to evaluate the epigenetic stability of organoids generated from colonic stem cells of patients with ulcerative colitis and healthy individuals. In order to fulfill the stated tasks, organoid cultures were cultured and characterized, DNA was isolated from crypt samples, biopsies and organoid cultures. Evaluation of the amount and quality of DNA, and bisulfite modification of the isolated DNA were performed. PCR amplification of bisulfite- modified DNA was achieved using biotin-labeled LINE-1 primers, and the size and quality of the resulting PCR products were analyzed on an agarose gel. Capture of biotin-labeled PCR products with streptavidin sepharose particles, preparation of amplified samples for pyrosequencing and quantitative determination of methylation of LINE-1 CpG islands were performed. The accomplished results showed that the cultured organoids were characterized by epithelial polarity, formed tight junctions, proliferating cells and a small part of specialized intestinal cells, i.e. colonocytes, goblet cells, enteroendocrine cells. The statistical analysis, based on the statistical comparison of the Mann-Whithey U-test, showed that in the control group, the methylation level of the CpG islands of the studied LINE-1 region remains unchanged, i.e. differences are not statistically significant, p > 0.05 for the entire model system. In the ulcerative colitis remission group, several statistically significant differences between the samples of biological material were determined: biopsy vs. organoids P0 p = 0.013, biopsy vs. organoids P1 p = 0.0024, biopsy vs. organoids P5 p = 0.016, and crypts vs. organoids P1 p = 0.018. In the group of active ulcerative colitis, a statistically significant difference was found only when comparing biopsy vs. organoid P1 (p = 0.023). The obtained results allowed us to conclude that the control 3D colon organoid model system, compared to its primary source (i.e. biopsy sample), is characterized by a stable level of DNA methylation, and statistically significant differences are observed in the ulcerative colitis groups. Comparing the level of LINE-1 methylation between different organoid pasages, it was found that there are no statistically reliable differences in any group, so the organoid culture remains epigenetically stable during the entire long-term cultivation. Also, statistical analysis revealed that the level of LINE-1 methylation in the study sample is not specific to the disease or its state, and it does not differ statistically when comparing the control and diseased groups at all points of the biological material, except for the colon organoid culture after the first pasage (P1).