Tarpląstelinio užpildo reikšmė skirtingų eozinofilų potipių adhezijai ir bronchų lygiųjų raumenų ląstelių proliferacijai sergant astma

Bakalauro baigiamojo darbo autorius: Dominyka Visockytė Tema: Tarpląstelinio užpildo reikšmė skirtingų eozinofilų potipių adhezijai ir bronchų lygiųjų raumenų ląstelių proliferacijai sergant astma. Mokslinis vadovas: dr. Andrius Januškevičius Atlikimo vieta: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Medicinos fakultetas, Pulmonologijos klinika Pulmonologijos laboratorija. Tyrimo tikslas: Įvertinti tarpląstelinio užpildo reikšmę skirtingų eozinofilų potipių adhezijai ir bronchų lygiųjų raumenų ląstelių proliferacijai sergant astma. Tyrimo uždaviniai: 1. Įvertinti alerginės astmos (AA), sunkios nealerginės eozinofilinės astmos (SNEA) ir sveikų asmenų (SA) eozinofilų potipių įtaką alfa-1 I tipo kolageno, fibronektino ir versikano genų raiškai bronchų lygiųjų raumenų ląstelėse. 2. Nustatyti eozinofilų adhezijos prie bronchų lygiųjų raumenų ląstelių ir jų išskirtų tarpląstelinio užpildo baltymų skirtumus sergant astma. 3. Ištirti eozinofilų sutrikdytos tarpląstelinio užpildo baltymų apykaitos įtaką bronchų lygiųjų raumenų ląstelių proliferacijai sergant astma. Tyrimo medžiagos ir metodai: Tyrime dalyvavo 20 asmenų. Iš pacientų periferinio kraujo buvo išskiriami eozinofilai magnetinės separacijos metodu bei nedelsiant sudaromos kombinuotos kultūros su bronchų lygiųjų raumenų ląstelėmis. Eozinofilų potipių adhezija buvo vertinama matuojant jų peroksidazės aktyvumą kombinuotoje kultūroje. Bronchų lygiųjų raumenų ląstelių proliferacija įvertinanta matuojant jų metabolonį aktyvumą Alamaro mėlio reagentu. Genų raiška buvo vertinta atliekant atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininės reakcijos analizę. Statistinė duomenų analizė buvo vertinama „GraphPad Prism 8“ programa. Duomenys statistiškai patikimi, kai ribinio reikšmingumo lygis buvo mažesnis už 0,05. Tyrimo rezultatai: Šis tyrimas parodė, kad tiek sergančiųjų astma tiek sveikų asmenų kraujo eozinofilų potipių adhezija prie TUB ir yra didesnė, lyginant su adhezija prie BLR ląstelių, tačiau šis skirtumas sergant astma yra didesnis. AA ir SNEA pacientų grupėse abu eozinofilų potipiai pasižymi stipresne adhezija, labiau skatina su sutrikusia TUB apykaita susijusią BLR ląstelių proliferaciją bei labiau didina COL1A1, FN ir VCAN genų raišką BLR ląstelėse, lyginant su SA grupės eozinofilų potipių poveikiu. Eosrez pasižymi stipresne adhezija visose tirtose grupėse, kai tuo tarpu AA ir SNEA pacientų eozinofilai labiau skatino su TUB susijusią proliferaciją ir didino FN geno raišką BLR ląstelėse, lyginant su Eosužd. Be to, COL1A1 geno raiška BLR ląstelėse ir su TUB susijusi jų proliferacija po inkubacijos su SNEA pacientų eozinofilų potipiais buvo reikšmingai didesnė, negu atitinkamais AA pacientų eozinofilų potipiais. Tyrimo išvados: 1. Sergančiųjų AA ir SNEA pacientų eozinofilų potipiai patikimai labiau skatina COL1A1, FN ir VCAN genų raišką BLR ląstelėse, lyginant su SA eozinofilų poveikiu. SNEA pacientų Eosrez turi didesnį poveikį COL1A1, FN ir VCAN genų raiškai BLR ląstelėse, lyginant su Eosužd, tuo tarpu AA pacientų grupėje ši tendencija pastebima tik vertinant FN raišką. Abiejų eozinofilų potipių poveikis COL1A1 geno raiškai BLR ląstelėse yra didesnis SNEA grupėje, lyginant su AA grupe. 2. Visų tiriamų grupių eozinofilų potipiai stipriau prisitvirtina prie TUB, lyginant su adhezija prie BLR ląstelių, o Eosrez adhezija yra reikšmingai didesnė, lyginant su tų pačių grupių Eosužd. Eozinofilų potipių adhezijos skirtumų tarp astmos grupių nėra nustatoma, tačiau jų adhezija prie BLR ląstelių arba jų išskirtų TUB yra patikimai didesnė, lyginant su SA eozinofilų potipiais. 3. Sergančiųjų astma eozinofilų potipių sutrikdyta TUB apykaita skatina BLR ląstelių proliferaciją, o Eosrez poveikis yra didesnis, lyginant su Eosužd, tuo tarpu SA eozinofilų potipiai patikimos įtakos neturi. Sergančiųjų SNEA eozinofilų poveikis nuo TUB priklausomai BLR ląstelių proliferacijai yra didesnis, lyginant su AA eozinofilų potipiais.

Author of bachelor thesis: Dominyka Visockytė Title: An effect of extracellular matrix on adhesion of distinct eosinophil subtypes and proliferation of bronchial smooth muscle cells in asthma. Scientific supervisor: Andrius Januškevičius, PhD Work was performed at: Laboratory of Pulmonology, Department of Pulmonology, Lithuanian University of Health Sciences Research object: To assess the significance of extracellular matrix on adhesion of different eosinophil subtypes and proliferation of bronchial smooth muscle cells in asthma. Research tasks: 1. To evaluate the influence of allergic asthma, severe eosinophilic asthma and eosinophil subtypes of healthy individuals on the expression of alpha-1 type I collagen, fibronectin and versican genes in airway smooth muscle (ASM) cells. 2. To determine differences in the adhesion of eosinophils subtypes to ASM cells and their secreted extracellular matrix (ECM) proteins in asthma. 3. To investigate the influence of eosinophils' disrupted ECM protein metabolism on the proliferation of ASM cells in asthma. Research subject and methods: We incluted 20 participanted individuals into the study. Magnetic separation was used to separate eosinophils from patients’ peripheral blood and individual combined cell cultures between isolated eosinophil subtypes and ASM cells were prepared. Adhesion of inflammatory- like (iEOS) and lung resident-like (rEOS) eosinophils were determined by measuring eosinophils peroxidase activity in the culture. ASM cells proliferation – by measuring cells methabolic activity with AlamarBlue reagent. For gene expression measurements the reverse transcription polymerase chain reaction analysis was used. To test if data was statistically reliable, softwhare “GraphPad Prism 8” was used. The data were statistically reliable when the marginal significance level was less than 0.05. Results: This study showed that the adhesion of blood eosinophil subtypes of both asthmatic and healthy individuals to ECM is higher compared to adhesion to ASM cells, moreover this difference is greater in asthma. In the AA and SNEA patient groups, both eosinophil subtypes exhibit stronger adhesion, promote the disturbed ECM metabolism-related ASM cells proliferation, and increase the expression of COL1A1, FN and VCAN genes in ASM cells more, compared to the effect of eosinophil subtypes in the SA group. rEOS exhibits stronger adhesion in all tested groups, while eosinophils from AA and SNEA patients promoted ECM-related proliferation more and increased FN gene expression in ASM cells compared to iEOS. In addition, COL1A1 gene expression in ASM cells and ECM-related proliferation after incubation with eosinophil subtypes from SNEA patients was significantly higher than the corresponding eosinophil subtypes from AA patients. Conclusion: 1. Eosinophil subtypes from AA and SNEA patients reliably promote COL1A1, FN and VCAN gene expression in BLR cells compared to SA eosinophils. In SNEA patients, rEOS has a greater effect on COL1A1, FN and VCAN gene expression in ASM cells compared to iEOS, whereas in AA patients this trend is observed only by evaluating FN expression. The effect of both eosinophil subtypes on COL1A1 gene expression in ASM cells is greater in the SNEA group compared to the AA group. 2. The subtypes of eosinophils of all studied groups adhere more strongly to ECM compared to adhesion to ASM cells, and rEOS adhesion is significantly higher compared to iEOS of the same groups. Differences in the adhesion of eosinophil subtypes between asthma groups are not detected, but their adhesion to ASM cells or ECM is reliably higher compared to SA eosinophil subtypes. 3. Disrupted ECM metabolism in asthmatic eosinophil subtypes promotes ASM cell proliferation, and the effect of rEOS is greater compared to iEOS, while SA eosinophil subtypes have no reliable effect. The effect of SNEA eosinophils on ECM-dependent ASM cell proliferation is greater compared to AA eosinophil subtypes.