Išemijos/reperfuzijos in vivo poveikis žiurkės inkstų mitochondrijų kardiolipino oksidacijai

Darbo tikslas: Įvertinti išemijos/reperfuzijos in vivo poveikį kardiolipino kiekybiniams ir kokybiniams pokyčiams žiurkės inkstų mitochondrijose ultraefektyviosios skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos metodu. Darbo uždaviniai: Įvertinti 30-60 minučių trukmės išemijos ir 30 minučių trukmės reperfuzijos in vivo poveikį žiurkės inkstų dominuojančių kardiolipinų kiekybiniams bei struktūriniams pokyčiams. Tiriamoji medžiaga. Fosfolipidas kardiolipinas išskirtas iš 8 – 12 savaičių amžiaus Wistar veislės žiurkių patinų inkstų mitochondrijų. Metodai. Atliekama 30, 40, 60 min išemija, užspaudžiant žiurkės inkstų arterijas chirurginiais mikro spaustukais, ir atleidžiama 30 min sukeliant reperfuziją. Tuomet inkstai išimami, nuplaunami ir iš jų diferencinio centrifugavimo metodu išskiriamos mitochondrijos. Po to spektrofotometriškai biureto metodu nustatomas baltymo kiekis mitochondrijose. Lipidų išskyrimas iš mitochondrijų atliekamas modifikuotu Folch metodu. Kardiolipino ir jo oksidacijos produktų analizė atliekama ultraefektyviosios skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos metodu. Rezultatai. Nustatėme, jog žiurkės inkstų mitochondrijose dominuoja kardiolipinas su keturiomis linolo rūgštimis (C18:2). Pagal gautus rezultatus matome, jog po 30, 40, 60 min išemijos bei 30 min reperfuzijos kardiolipino kiekis padidėjo atitinkamai 1,4 karto, 1,9 karto ir 2,4 karto lyginant su kontrole. UPLC-MS metodu nustatėme, jog kardiolipinas gali būti oksiduojamas papildomai prisijungiant iki aštuonių deguonies atomų. Nustatėme, kad kardiolipinas buvo labiausiai oksiduojamas papildomai prisijungiant vieną, keturis ir penkis deguonies atomus. Po I30R30 bei I40R30 oksiduoto kardiolipino kiekis didėjo, o po I60R30 – sumažėjo. Išvados. Nustatėme, jog po 60 min išemijos bei 30 min reperfuzijos dominuojančio kardiolipino kiekis reikšmingai padidėjo 2,4 karto lyginant su kontrole. 40 min išemija ir 30 min reperfuzija sukėlė reikšmingą oksiduoto kardiolipino, papildomai prisijungusio keturis ir penkis deguonies atomus, kiekio padidėjimą.

The aim of the investigation: To evaluate the effect of ischemia/reperfusion in vivo on the quantitative and qualitative changes of cardiolipin in rat kidney mitochondria by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry. Objectives: To assess the in vivo effects of 30-60 minutes of ischemia and 30 minutes of reperfusion on the quantitative and structural changes of the predominant cardiolipins in rat kidney. The object of the investigation. The phospholipid cardiolipin was isolated from mitochondria of the kidneys of 8-12 week old male Wistar rats. Methods. Ischemia was induced by clamping rat renal arteries with surgical micro-clamps for 30, 40, 60 min and released to induce reperfusion for 30 min. The kidneys were removed, washed and mitochondria were isolated by differential centrifugation. The mitochondrial protein amount was determined spectrophotometrically by the biuret method. Lipidisolation from the mitochondria was performed by the modified Folch method. Analysis of cardiolipin and its oxidation products was carried out by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS). Results. We found that in rat kidney mitochondria dominant cardiolipin had four linoleic acids (C18:2). The results showed that after 30, 40, 60 min of ischemia and 30 min of reperfusion, cardiolipin levels increased respectively by 1,4, 1,9 and 2, 4 times compared with control group. By UPLC-MS, we found that cardiolipin can be oxidised binding up to eight additional oxygen atoms. We observed that cardiolipin was most oxidised by binding one, four and five additional oxygen atoms. The amount of oxidised cardiolipin increased after I30R30 and I40R30 and decreased after I60R30. Conclusions. Results showed that 60 min of ischemia and 30 min of reperfusion caused a significant increase of dominant cardiolipin species by 2,4 times compared with control group. 40 min ischemia and 30 min reperfusion caused a significant increase in tetralinoleoyl-cardiolipin oxidized species with extra four and five oxygen atoms.