Options
Žiurkės raumeninės kilmės kamieninių ląstelių išskyrimas ir charakterizavimas
Komisijos sekretorius / Committee Secretary | |
Komisijos pirmininkas / Committee Chairman | |
Komisijos narys / Committee Member | |
Komisijos narys / Committee Member | |
Komisijos narys / Committee Member | |
Komisijos narys / Committee Member | |
Komisijos narys / Committee Member | |
Komisijos narys / Committee Member | |
Komisijos narys / Committee Member | |
Komisijos narys / Committee Member | |
Komisijos narys / Committee Member | |
Komisijos narys / Committee Member | |
Komisijos narys / Committee Member |
Tyrimo tikslas: Išskirti, kultivuoti ir charakterizuoti žiurkės raumeninės kilmės kamienines ląsteles (RKKL). Tyrimo uždaviniai: Išskirti ir kultivuoti žiurkės raumeninės kilmės kamienines ląsteles, įvertinti jų morfologiją bei proliferacijos gebą bei atlikti jų kokybinę analizę taikant imunofluorescensijos ir tėkmės citometrijos metodus. Įvertinti RKKL multipotentinės diferenciacijos gebą. Metodika: Raumeninės kilmės kamieninės ląstelės buvo išskiriamos iš 3 savaičių Wistar veislės žiurkių patino. Ląstelių išskyrimui buvo naudota metodika, pagrįsta ląstelių prikibimo prie kolagenu padengto paviršiaus greičiu. Išskirtos ląstelės pirma buvo įvertintos morfologiškai bei įvertintas jų proliferacijos greitis skaičiuojant populiacijos dvigubėjimo laiką. RKKL buvo charakterizuojamos vertinant jų gebą diferencijuotis miogenine, osteogenine, chondrogenine ir adipogenine kryptimis, taip pat atliktas jų paviršinių biožymenų (CD34, CD45, CD90, c-kit bei desmino) kokybinė analizė taikant imunofluorescensijos metodą bei biožymenų (CD34, CD45, CD59 bei CD90) kiekybinė analizė taikant tėkmės citometrijos metodą. Tyrimo rezultatai: RKKL buvo sėkmingai išskirtos naudojant prikibimo prie kolagenu padengto paviršiaus metodą, įvertinta jų morfologija (mažos, apvalios, trikampio ar verpstės formos) bei proliferacijos greitis (dvigubėjimo laikas buvo 43,64 ±3,10 valandų). RKKL gebėjo diferencijuotis visomis keturiomis tirtomis kryptimis (miogenine, osteogenine, chondrogenine bei adipogenine). Miogeninės diferenciacijos baigtis buvo patvirtinta morfologiškai (ląstelės buvo skaidulinės bei multibranduolinės) bei įvertinta desmino ekspresija (>98%). Osteogeninė diferenciacija buvo patvirtinta Von Kossa dažymu, chondrogeninė- alciano mėlynuoju dažymiu, o adipogeninė- oil red o dažymu. Imunofluorescensijos metu buvo nustatyta, kad RKKL gausiai ekspresuoja CD90 bei desminą, menkai ekspresuoja c-kit, o biožymenims CD34 bei CD45 yra neigiamos. Tėkmės citometrijos metodu buvo nustatyta, kad biožymenys CD34 bei CD45 yra praktiškai neekspresuojami (<1%), CD59 yra ekspresuojamas 48%, CD90- 99,7%, o c-kit- 1,17%. Išvados: RKKL išskyrimas bei kultivavimas yra nesudėtingas, jos geba greitai proliferuoti, yra multipotentinės, ekspresuoja kamieninėms ląstelėms būdingą biožymenį c-kit, mezenchiminių ląstelių žymenis CD90 ir CD59, raumeninėms ląstelėms būdingą žymenį desminą, neekspresuoja hematopoetinėms bei endotelio ląstelėms būdingų žymenų (CD45 bei CD34).
Aim of the study: Isolation, cultivation and characterization of rat muscle-derived stem cells (MDSCs). Tasks of the study: Isolate and cultivate rat MDSCs, evaluate their morphology and proliferation capacity. Carry out their qualitative analysis using immunohistochemistry and flow cytometry. Evaluate their multi- lineage differentiation. Methods: MDSCs were isolated from a 3 week old male rat (Wistar breed). The cells were isolated using the pre-plate method. First the isolated MDSCs were evaluated morphologically and their proliferation rate was evaluated by calculating the population doubling time. MDSCs were characterized by their multipotential (myogenic, osteogenic, chondrogenic and adipogenic) differentiation ability. Qualitative analysis of surface biomarkers CD34, CD45, CD90, c-kit and desmin was carried out using immunohistochemistry and quantitative analysis of biomarkers CD34, CD45, CD59 and CD90 was performed using flow cytometry. Results: MDSCs were successfully isolated using the pre-plate technique. They appeared as small round, triangular or spindle shaped cells. The population doubling time was 43.64±3.10 hours. MDSCs were able to differentiate into all four cell lineages (myogenic, osteogenic, chondrogenic and adipogenic). Myogenic differentiation was determined morphologically (fibrous, multinuclear cells) and by their expression of desmin (>98%). Osteogenic differentiation was determined by Von Kossa staining, chondrogenic - by alcian blue staining, adipogenic - by oil red o staining. Immunohistochemistry showed that MDSCs are highly positive for CD90 and desmin, poorly positive for c-kit and negative for CD34 and CD45. Flow cytometry showed that MDSCs are negative (<1%) for biomarkers CD34 and CD45, poorly positive for c-kit (1.17%), the expression of CD59 was 48% and for CD90 - 99.7%. Conclusion: The isolation and cultivation of MDSC did not cause difficulties, they were able to proliferate quickly. MDSCs are multipotential, they express stem cell marker c-kit, mezenchymal cell markers CD90 and CD59, a muscle-specific marker desmin and do not express hematopoietic and endothelial markers CD45 and CD34.