LIM2 geno 4 egzono sekų analizė ir galimų sąsajų paieška su kataraktos pasireiškimu įvairių veislių šunų populiacijose
Semionovaitė, Vesta |
Pranckėnienė, Laura |
Bakalauro baigiamojo darbo tikslas: Nustatyti LIM2 geno vieno nukleotido polimorfizmų 4-ąjame egzone sąsajas su kataraktos pasireiškimu įvairių veislių šunų populiacijoje. Darbo uždaviniai: 1. Paruošti mėginius sekoskaitos tyrimui. 2. Atlikti sekoskaitos analizę. Tyrimo objektas: DNR, kuri buvo išskirta iš įvairių veislių šunų kraujo. Tyrimo metodai: Tyrime buvo naudojamas įvairių veislių, įskaitant ir mišrūnus, šunų periferinis kraujas. Silikagelio kolonėlių metodu iš baltųjų kraujo ląstelių išskirta DNR. Metodas veikia principu, jog DNR gali prisitvirtinti prie silikagelio naudojant etanolį, o išvalius visas kitas medžiagas iš mėginio DNR vėl galimą atlaisvinti nuo kolonėlės naudojant eliucijos buferį. Taip pat, nustatyta išskirtos DNR koncentracija bei švarumas naudojant spektrofotometrą. Genetinė informacija toliau gausinama naudojant PGR metodą, rezultatai stebimi agarozės gelyje. LIM2 2FR ir 3FR tiesioginis (ang. forward) ir atvirkštiniai (ang. reverse) pradmenys išrinkti remiantis kitų autorių moksliniais darbais. Centrifugavimo metodu išgryninamas PGR produktas. Mėginiai po to buvo siųsti į Nyderlandus, Amsterdamą, į Macrogen Europe B.V. laboratoriją, kur buvo atlikta Sanger tipo sekoskaita. Gautos sekos toliau analizuotos novoSNP 3.0.1. programa. Tirtos sekos lygintos su referentine, gauta iš Ensembl duomenų bazės. LIM2 geno sekos, taip pat, lygintos ir su kitų gyvūnų sekomis UCSC Genome Browser. Tyrimo rezultatai: LIM2 4 egzone buvo rastas tik vienas polimorfizmas, tačiau introninėje dalyje esančioje tarp ketvirtojo ir penktojo egzono rastos delecijos. Sekos polimorfizmas rastas tik viename mėginyje ir jo chromatograma nebuvo geros kokybės. Delecijos kartojosi keliuose mėginiuose ir buvo tuose pačiuose pozicijose. Išvados: 1. Tarp 4 ir 5 egzono esančiame introne nustatytos pasikartojančios delecijos. Žinant, jog visi tirtieji šunys sirgo katarakta, galima įtarti, jog ir šie pakitimai galėjo turėti įtakos kataraktogenezei, tačiau šiai hipotezei patvirtinti reiktų kartoti tyrimus su didesne tiriamųjų imtimi. 2. LIM2 geno ketvirtajame egzone rastas tik vienas polimorfizmas. Galima įtarti, jog jis gali sietis su kataraktogeneze. Rezultatams patvirtinti reikalinga detalesnė analizė, išsamesni tyrimai su didesne imtimi.
The aim of the research: The aim of this study is to determine the relationship between LIM2 gene single nucleotide polymorphism (SNP) in exon 4 and the occurrence of cataract in a population of dogs of various breeds. Tasks of the research: 1. Prepare samples for sequencing. 2. Perform sequence analysis. The object of the research: DNA extracted from the blood of various dog breeds. Research methods: Peripheral blood collected from various breeds of dogs, including mixed breed ones, was used in this study. To extract DNA from the white blood cells we used silica gel column method. This method works because blood attaches itself to gel once introduced to ethanol and after removing every other part of blood the DNA can be made soluble again by using elution buffer. Spectrophotometer is used to measure DNA concentration and to see how pure it is. The next step is to amplify the genetical information by using PCR method, results then can be seen with electrophoresis. LIM2 2FR and 3FR forward and reverse primers were selected from the works of already conducted research. After electrophoresis you can see fragments of specific length in the agarose gel. Then the PGR product needs to be purified, after this samples were sent to Macrogen Europe B.V. laboratory in the Netherlands, Amsterdam, where they were sequences with Sanger method. DNA sequences were analyzed with novoSNP 3.0.1. software. The sequences were matched with a reference sequence found in Ensambl database. LIM2 gene sequences were also matched with genetical information of other animals found in UCSC Genome Browser. Results: Only one SNP was found in LIM2 4th exon, however in one of the introns (4-5) a couple of deletions were found. The SNP was only found in one of the samples and the chromatogram was of poor quality. The deletions were repeated in several samples and in the same positions in the gene. Conclusions: 1. Same deletions were repeated in several samples in the intron between the 4th and the 5th exons. Knowing that all of the samples were collected from dogs with cataracts, these deletions may have some sort of association with cataractogenesis, however to confirm the hypothesis more research should be made with a larger sample size. 2. In LIM2 4th exon only one SNP was found. It can be suspected that it may be related to cataractogenesis. More research is needed for a more detailed analysis.