Mikroglijos ląstelių žūties ir aktyvacijos tyrimas neuropatologijos atveju
Sakavičius, Haroldas |
Recenzentas / Reviewer |
Bakalauro baigiamojo darbo autorius: Sakavičius H. Tema: „Mikroglijos ląstelių žūties ir aktyvacijos tyrimas neuropatologijos atveju“ Mokslinis vadovas: dr. Silvija Jankevičiūtė Atlikimo vieta: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Neuromokslų institutas, Biochemijos laboratorija Santraukos turinys: Vis daugiau epidemiologinių ir mokslinių tyrimų duomenų sieja neurotropinius virusus su pagreitėjusiu smegenų senėjimu ir padidėjusia neurodegeneracinių sutrikimų rizika. Yra įrodymų, kad kai kurie pavieniai virusų baltymai gali praeiti kraujo smegenų barjerą ir taip sukelti neurouždegimą ar kitais būdais sutrikdyti smegenų funkcijas [1]. Žinoma, jog virusų struktūriniai komponentai prisideda prie tokių neurodegeneracinių ligų kaip Parkinsono ar Alzheimerio liga. Taip pat manoma, jog virusų struktūriniai komponentai gali sukelti mikroglijos ląstelių aktyvaciją, skatinti jų proliferaciją bei skatina mikroglijos ląsteles fagocituoti [2]. Tyrimo metu buvo tiriamas skirtingų koncentracijų LOX (1µg/ml, 10µg/ml ir 100µg/ml) ir PIC (100ng/ml ir 1µg/ml) poveikis grynoms mikroglijos ląstelių kultūroms, esant 24 val. inkubaciniam laikotarpiui. Tyrimams naudotos grynos pirminės mikroglijos ląstelių kultūros išskirtos iš 5-7 dienų amžiaus, abiejų lyčių Wistar veislės žiurkių jauniklių smegenų žievės. Ląstelių gyvybingumas, proliferacija, fagocitinis aktyvumas buvo nustatoma fluorescencinės mikroskopijos metodu. Glutamato kiekis mikroglijos ląstelių augimo terpėje buvo nustatomas spektrofotometriniu metodu. Mikroglijos ląstelių aktyvacijos vertinimas, įvertinant mikroglijos ląstelių aktyvacijos žymens – Iba1 baltymo raiškos pokyčius ląstelių kultūrose, buvo atliekamas imunofluorescencijos metodu. Tyrimų metu buvo nustatyta, kad Toll-like receptorių (TLR7 ir TLR3) aktyvikliai – LOX ir PIC po 24 val. inkubacijos neturėjo poveikio mikroglijos ląstelių gyvybingumui. Ląstelių inkubacija su didžiausia LOX koncentracija (100µg/ml) skatino ląstelių proliferaciją ir statistiškai reikšmingai padidino mikroglijos ląstelių skaičių (apie 35 proc.), bei pasižymėjo mikroglijos ląstelių fagocitinį aktyvumą didinančiu poveikiu, lyginant su kontroline ląstelių grupe po 24 val. inkubacinio laikotarpio. Nei viena PIC koncentracija (100ng/ml ir 1µg/ml) bei mažesnės LOX koncentracijos (1µg/ml, 10µg/ml) neturėjo statistiškai reikšmingo poveikio ląstelių skaičiaus kitimui ar fagocitozei. Nustatyta, kad po 24 val. inkubacinio laikotarpio LOX (1µg/ml, 10µg/ml ir 100µg/ml) ir PIC (100ng/ml ir 1µg/ml) neturėjo poveikio glutamato išsiskyrimui į mikroglijos ląstelių augimo terpę bei nesukėlė Iba1 raiškos padidėjimo mikroglijos ląstelių kultūroje, kas galėtų rodyti galimą mikroglijos ląstelių uždegiminį atsaką ir ląstelių aktyvaciją.
Author of bachelor thesis: Sakavičius H.
Title: "Investigation of microglia cell death and activation under neuropathological conditions"
Scientific supervisor: PhD Silvija Jankevičiūtė
Work was performed at: Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Neuroscience Institute, Laboratory of Biochemistry. Summary: Growing epidemiological and experimental evidence suggests that neurotropic viruses are related to accelerated brain aging and an increased risk of neurodegenerative disorders. There is evidence that some proteins shed from viruses can cross BBB and induce neuroinflammation or otherwise impaire brain functions funkcijas [1]. It is known that structural components of viruses contribute to neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's. It is assumed that structural components of viruses are also considered to induce microglial cell activation and proliferation, and to promote microglial cells phagocytosis [2]. In this study different LOX (1µg/ml, 10µg/ml ir 100µg/ml) and PIC (100ng/ml ir 1µg/ml) were tested. Pure primary microglial cell cultures prepared from 5–7-day-old Wistar rats pups (both genres) were used in this study. The viability, proliferation, phagocytic activity of the cells were assessed by fluorescence microscopy method. Amount of glutamate microglial cell cultures was determined spectrophotometrically. Assessment of microglial cell activation by evaluating changes in the expression of the microglial cell activation marker – Iba1 protein in cell cultures was performed by immunofluorescence method. It was found that Toll-like repectors activators (TLR7 and TLR3) – LOX and PIC had no effect on microglial cells viability after 24 h incubation. Cell incubation with the highest concentration of LOX (100µg/ml) stimulated microglial cell proliferation and significantly increased the number of microglia cells (about 35%) and also stimulated phagocytic acitvity of microglial cell compared to the control group after 24 hours incubation. Neither PIC (100ng/ml and 1µg/ml) nor lower LOX concentrations (1µg/ml, 10µg/ml) had a statistically significant effect on cell number or microglial cells phafocytosis. We also found that microglial cells incubation with LOX (1µg/ml, 10µg/ml and 100µg/ml) and PIC (100ng/ml and 1µg/ml) did not affect the release of glutamate into the microglial cell growth medium after a 24 h incubation period and did not cause an increase of Iba1 expression in microglia cell cultures, which could be indicative of a possible microglial cellular inflammatory response and cellular activation.