Prouždegiminių veiksnių toksinio poveikio smegenų ląstelėms tyrimas

Tyrimo tikslas: Ištirti prouždegiminių veiksnių poveikį mikroglijos ląstelių kultūrai. Tyrimo uždaviniai: Įvertinti bakterijų lipopolisacharido, loksoribino, poliinozininės:policitidilinės rūgšties ir α-sinukleino poveikį BV-2 ląstelių daugiabranduoliškumui; Įvertinti bakterijų lipopolisacharido, loksoribino, poliinozininės:policitidilinės rūgšties ir α-sinukleino poveikį S100A8/S100A9 baltymo kiekiui BV-2 ląstelių lizatuose ir auginimo terpėje. Tyrimo objektas: BV-2 mikroglijos ląstelių linija. Metodai: BV-2 ląstelių kultūros po užsėjimo buvo 24 val. veikiamos skirtingomis prouždegiminių veiksnių (0,1 µg/ml – 50 µg/ml bakterijų lipopolisacharido (LPS), 100 µg/ml – 1 mg/ml loksoribino (LOX), 100 µg/ml – 1 mg/ml poliinozininės:policitidilinės rūgšties (Poly I:C) ir 500 nM – 1 µM rekombinantinio α- sinukleino) koncentracijomis. Ląstelių daugiabranduoliškumas buvo tiriamas šviesinės bei fluorescencinės mikroskopijos metodais. S100A8/S100A9 baltymų kiekis BV-2 ląstelių lizatuose ir auginimo terpėje po 24 val. trukusios simuliacijos buvo vertinama kiekybiniu imunofermentiniu ELISA metodu. Rezultatai ir išvados: Nustatėme, kad prouždegiminiai veiksniai - 50 µg/ml LPS ir 100 µg/ml LOX po 24 val. inkubacijos sąlygojo BV-2 ląstelių daugiabranduoliškumą, daugiabranduolių ląstelių skaičius išaugo 8-9 kartus, lyginant su kontrole, o Poly I:C ir α-sinukleinas BV-2 ląstelių daugiabranduoliškumo nesukėlė. Taip pat nustatėme, kad LPS (0,1 µg/ml – 50 µg/ml), LOX (100 µg/ml – 1 mg/ml), Poly I:C (100 µg/ml – 1 mg/ml) ir α-sinukleinas (500 nM) neturi poveikio S100A8/S100A9 baltymų kiekiui BV-2 ląstelių lizatuose po 24 val. inkubacijos: S100A8/S100A9 kiekis tiek kontrolės, tiek LPS paveiktų ląstelių lizatuose buvo panašus (apie 0,7 ± 0,1 ng/ml), taip pat S100A8/S100A9 kiekis tiek kontrolės, tiek LOX, Poly I:C ir α-sinukleinu paveiktų ląstelių lizatuose buvo panašus (apie 1,6 ± 0,4 ng/ml). BV-2 ląstelių auginimo terpėje S100A8/S100A9 baltymo buvimo, paveikus ląsteles LPS, LOX, Poly I:C ir α-sinukleinu, nenustatėme. 1 išvada: Prouždegiminiai veiksniai LPS ir LOX sukelia BV-2 ląstelių daugiabranduoliškumą po 24 val. inkubacijos, lyginant su kontrole. Poly I:C ir α-sinukleinas poveikio BV-2 ląstelių daugiabranduoliškumui po 24 val. neturi. 2 išvada: LPS, LOX, Poly I:C ir α-sinukleinas neturi poveikio S100A8/S100A9 baltymų kiekiui BV-2 ląstelių lizatuose po 24 val. inkubacijos. 24 val. BV-2 ląsteles veikiant LPS, LOX, Poly I:C ir α-sinukleinu, BV-2 ląstelių auginimo terpėje S100A8/S100A9 baltymų nebuvo aptikta.

The aim of the study: To investigate the effect of proinflammatory agents on microglial cell culture. Objectives: To evaluate the effect of bacterial lipopolysaccharide, loxoribine, polyinosinic:polycytidylic acid and α-synuclein on the multinucleation of BV-2 cells; Evaluate the effect of bacterial lipopolysaccharide, loxoribine, polyinosinic:polycytidylic acid and α-synuclein on the amount of the S100A8/S100A9 protein in the lysates and growing medium of BV-2 cells. The object of investigation: BV-2 microglial cell line. Methods: BV-2 cell cultures were exposed to different concentrations of proinflammatory agents for 24 hours (0,1 µg/ml – 50 µg/ml bacterial lipopolysaccharide (LPS), 100 µg/ml – 1 mg/ml loxoribine (LOX), 100 µg/ml – 1 mg/ml polyinosinic:polycytidylic acid (Poly I:C) and 500 nM – 1 µM recombinant α- synuclein). The multinucleation of cells were assessed using light and fluorescence microscopy. The amount of S100A8/S100A9 in the lysates and growing medium of BV-2 cells after a 24-hour simulation was assessed by solid-phase sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results and conclusions: We found that proinflammatory agents - 50 μg/ml of LPS and 100 μg/ml of LOX after 24 hours of incubation caused the multinucleation of BV-2 cells, the number of multinucleated cells compared to the control increased 8-9 times, however Poly I:C and α-synuclein did not cause multinucleation of BV-2 cells. We also found that the LPS (0.1 μg/ml – 50 μg/ml), LOX (100 μg/ml – 1 mg/ml), Poly I:C (100 μg/ml – 1 mg/ml) and α-synuclein (500 nM) had no effect on the protein S100A8/S100A9 amount in the BV-2 cell lysates after 24 hours of incubation: S100A8/S100A9 levels in control and with LPS affected cell lysates were similar (approximately 0.7 ± 0.1 ng/ml), also the levels of S100A8/S100A9 in both of control and LOX, Poly I:C and α-synuclein affected cell lysates were similar (approximately 1.6 ± 0.4 ng/ml). In the BV-2 cell growing medium, we did not determine the presence of the S100A8/S100A9 protein after the cell exposure to LPS, LOX, Poly I:C and α-synuclein. 1 conclusion: compared to the control proinflammatory agents LPS and LOX causes the multinucleation of BV-2 cells after 24 hours of incubation. Poly I:C and α-synuclein have no effect on the multinucleation of BV-2 cells after 24 hours. 2 conclusion: LPS, LOX, Poly I:C and α-synuclein have no effect on the protein S100A8/S100A9 amount in the BV-2 cell lysates after 24 hours of incubation. After 24 hours of exposure to LPS, LOX, Poly I:C and α-synuclein on BV-2 cells, the S100A8/S100A9 protein was not detected in the BV-2 cell growing medium.