Investigation of mTOR, JAK/STAT, and Hedgehog pathways inhibitor effect on the proliferation of haematological cancer cell lines

Abstract

Klasikinėms BCR/ABL neigiamoms mieloproliferacinėms ligoms (MPL) būdinga nuolat aktyvi JAK/STAT signalo perdavimo sistema. Nustatyta, kad klinikinėje praktikoje taikomi JAK2 inhibitoriai nėra specifiniai mutacijos atveju ir nepakankamai slopina neoplastinę kloninę hematopoezę, todėl būtina ieškoti naujų terapinių MPL galimybių. Potencialus gydymo taikinys yra ląstelės signalo perdavimo sistemos – PI3K/Akt/mTOR ir Hedgehog. Šios studijos tikslas – nustatyti ir palyginti specifinių JAK/STAT, PI3K/Akt/mTOR bei Hedgehog signalo perdavimo inhibitorių poveikį hematologinėms ląstelių linijoms. Tyrimo metu buvo naudojamos SET-2 ląstelės, turinčios JAK2 p.V617F mutaciją, ir UT-7 ląstelių linija, pasižyminti laukinio tipo JAK2. Specifinių signalo perdavimo inhibitorių poveikis ištirtas atsižvelgiant į ekspozicijos laiką ir dozes. Ląstelių gyvybingumas nustaytas Tripano mėlio ir alamar-Blue testais. IC50 reikšmės panaudotos įvertinant inhibitorių efektyvumą. Statistinė analizė atlikta pagal t-testą. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp tiriamų grupių, kai p < 0,05. Tyrimo metu nustatyta, kad visi specifiniai inhibitoriai mažino ląstelių gyvybingumą didėjant koncentracijai ir ekspozicijos laikui. Ląstelių, turinčių JAK2 mutaciją, proliferacija sutrikdyta reikšmingai mažesnėmis inhibitorių koncentracijomis, palyginti su ląstelėmis, neturinčiomis JAK2 mutacijos. Šio in vitro tyrimo rezultatai rodo, kad JAK/STAT ir alternatyvūs PI3K/Akt/mTOR bei Hedgehog inhibitoriai pasižymi antiproliferaciniu poveikiu. Tolesniuose tyrimuose būtina išanalizuoti PI3K/Akt/mTOR, JAK/STAT ir Hedgehog signalinių molekulių aktyvumą genų ir baltymų lygmeniu panaudojant MPL ląstelių modelius. Constitutively activated JAK/STAT signaling pathway is a common feature of the BCR/ABL-negative classic myeloproliferative neoplasms (MPN). JAK2 small-molecule inhibitors have been proven to be clinically efficacious; however, they are not mutation-specific and competent enough to suppress neoplastic clonal haematopoiesis. There is a need for exploring new therapeutic strategies for MPN. Additional signaling systems, such as PI3K/Akt/mTOR and Hedgehog, are a potential treatment target. The aim of this study was to characterise and compare the effects of specific JAK/STAT, PI3K/Akt/mTOR, and Hedgehog signaling inhibitors in haematological cell cultures. JAK2 p.V617F mutated SET-2 and JAK2 wild-type UT-7 human cell lines were employed in our study. The effect of specific signaling pathway inhibitors was studied as time- and dose-response experiments. Viability was measured by trypan blue exclusion and alamarBlue assays. IC50 values were used to compare the effectiveness of inhibitors in decreasing cell viability. Independent sample t-test was used for statistical comparisons between experimental groups. p < 0.05 was considered significant. Our results indicate that all specific inhibitors progressively reduced the number of viable cells as the concentration and exposure duration increased. Inhibitors impaired the proliferation of JAK2 mutated cells at significantly lower doses compared to wild-type JAK2 cell line. These in vitro data indicate that JAK/STAT and alternative PI3K/Akt/mTOR and Hedgehog inhibitors have a potential anti-proliferative efficacy. Future studies, involving direct screening of PI3K/Akt/ mTOR, JAK/STAT, and Hedgehog signaling molecules activity, at gene and protein level in cell-based MPN model, are required.