Naujai nustatytų mažųjų RNR validavimas in vitro, nuslopinus jų kanoninius biogenezės elementus

Abstract

Įžanga MikroRNR (miRNR) – tai mažos, 19-25 nukleotidų ilgio, baltymų nekoduojančios reguliacinės RNR molekulės, kurių biologinė funkcija – potranskripcinis geno – taikinio raiškos slopinimas, iš dalies ar visiškai komplementariai prisijungiant prie jo informacinės RNR (iRNR) ir taip užkertant kelią tolimesnei baltymo transliacijai [1]. Šiuo metu žinoma daugiau kaip 2600 subrendusių žmogaus miRNR sekų (miRBase v.22, 2018) ir spėjama, kad jos gali valdyti daugiau nei 2/3 žmogaus transkriptų [2]. Jų vaidmuo biologiniuose procesuose yra įvairialypis, o miRNR raiškos ar funkcijų sutrikimas yra siejamas su įvairių patologinių būklių – neurodegeneracinių, autoimuninių, onkologinių ir kitų ligų – atsiradimu [3–5]. Susidomėjus miRNR kaip potencialiais bioţymenimis atliekama daug sekoskaitos tyrimų, kurie rodo, kad dar yra daug naujų miRNR, kurių validumas turi būti patvirtintas. Nuo 2001 m., kai miRNR pradėtos nustatinėti sistemiškai, šios reguliacinės molekulės identifikuojamos ir apibūdinamos remiantis jų biogeneze [6]. Tikslas Įvertinti, ar naujai anotuotų mikro RNR brendimas vyksta kanoniniu mikro RNR biogenezės keliu. Metodai Tyrimams naudotos komercinės kolorektalinio vėžio ląstelių linijos Caco2 ir HT-29. Atlikti keturi nepriklausomi eksperimentai, kurių metu ląstelės transfekuotos sintetinėmis neigiamos kontrolės siRNR (siNC), teigiamos kontrolės siRNR (siPC:GAPDH) ir siRNR, nukreiptomis prieš pagrindinius miRNR biogenezės elementus (siDGCR8, siRNASEN, siDICER1, siEIF2C2) (Ambion by Life Technologies, JAV), naudojant Lipofectamine™ RNAiMAX transfekcijos reagentą (Invitrogen™, JAV). Galutinė siRNR koncentracija šulinėlyje – 400 nM. Po transfekcijos ląstelės 48 val. inkubuotos 37°C 5% CO2. Visuminė ląstelių RNR išgryninta miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Nyderlandai) rinkiniu. RNR koncentracija ir švarumas įvertintas Qubit[...].