In-situ bakterijų atsparumo antibiotikams matavimai registruojant slopstančiąją modą sub-mikroninėje difrakcinėje gardėle

Abstract

Vienas iš dažniausiai farmacijos pramonėje sprendžiamų uždavinių yra vaistų veiksmingumo vertinimas. Tam naudojami mikrobiologiniai tyrimai yra tikslūs, tačiau jie reikalauja didelių laiko sąnaudų. Šio darbo tikslas yra ištirti galimybes realiu laiku stebėti bakterijų kultūros (Staphyloccocus aureus 8,8 mlrd./ml.) sienelių pakitimus jas veikiant skirtingu benzilpenicilino (500.000 v.v/ml.) kiekiu. Matavimams buvo naudojamas originalios konstrukcijos automatizuotas poliarizuotos polichromatinės šviesos atspindžio matavimų stendas. Tirpalas buvo tiriamas termostatuojamoje kameroje (talpa ~1,6 ml), kurios vienoje sienelėje buvo įtaisytas rezonansinėms savybėms pasižymintis lustas su amorfinės deimanto tipo anglies dangoje išėsdinta sub-mikroninio periodo (0,4 μm) difrakcinė gardele. Nuolatos registruojant atspindžio spektre stebimų smailių padėtis ir amplitudes realiu laiku galima registruoti su lustu kontaktuojančio skysčio dielektrinės skvarbos pokyčius. Eksperimento metu į ląstelių kultūrą vienodais laiko tarpais (5 min.) buvo įleidžiami vienodi antibiotiko kiekiai (0,1 ml x 4 kartus, 0,2 ml x 2 kartus, 0,4 ml x 1 kartą). Naujai pasiūlyto metodo jautrumo ir triukšmo signalo lygio įvertinimui buvo atliekami kontroliniai matavimai: antibiotiko pylimas į fiziologinį tirpalą (atkartojant identiškas sąlygas kaip ir su ląstelėmis); vien antibiotiko, fiziologinio tirpalo (0,9%) druskos tirpalas) ir ląstelių matavimai. Siekiant patvirtinti bakterijų sąveikos su antibiotikais tyrimų patikimumą, lygiagrečiai atlikti: 1) standartiniai mikrobiologiniai tyrimai (bakterijų sėjimas ant sojos agaro); 2) bakterijų morfologiniai tyrimai skenuojančiu elektronų mikroskopu (SEM). Atlikdami in-situ matavimus pasiūlytu metodu bei realiu laiku automatiškai analizuodami atspindžio spektrus mes stebėjome rezonansinės smailės poslinkį ant Avantes spektrometro 2048 taškų liniuotės jutiklio. Lygindami peni cilino pylimo į bakterijų tirpalą su kontroliniu matavimu (0,1 ml x 4 penicilinas į fiziologinį) mes galime lyginti atspindžio spektre stebimų smailių poslinkio vertes (1 pav.). Tirpale esant bakterijoms šie poslinkiai buvo didesni nei antibiotiko įpylus į fiziologinį tirpalą, todėl mes darome prielaidą jog naujai pasiūlytas metodas registravo ląstelių sienelių pažeidimus. [...].