KI Vaistų taikinių histopatologijos laboratorija (10.11)

Vėžinių ląstelių sąveika turi reikšmingos įtakos trejopai neigiamo krūties vėžio (TNBC) atsparumui chemoterapiniams vaistams. Doksorubicinas ir paklitakselis yra vieni pagrindinių vaistų, vartojami gydyti šio tipo navikus.

Tyrimo tikslas buvo įvertinti TNBC ląstelių sąveikos įtaką atsparumui vaistams (doksorubicino ir paklitakseliui). Išskirtos ir charakterizuotos septynios fenotipiškai skirtingos MDA-MB-231 sublinijos.

Tyrimo metodai: imunofluorescencinis dažymas, MTT testas, žaizdos gijimo metodas, magnetinis 3D biospausdinimas sferoidų formavimui.

Rezultatai parodė, jog greičiau migruojančių D8 ląstelių derinys su doksorubicinui jautriomis F5 ląstelėmis padidina atsparumą paklitakseliui ląstelių vienasluoksnyje, bet ne sferoiduose. Doksorubicinui ir paklitakseliui atsparias H2 sublinijos ląsteles derinant su greičiau migruojančiomis D8 arba doksorubicinui jautriomis F5 ląstelėmis, padidėja atsparumas paklitakseliui ląstelių vienasluoksnyje, bet sumažėja atsparumas abiem junginiams sferoiduose. Doksorubicino transportas į sublinijų ląsteles skiriasi: F5 sublinijos ląstelėse kaupiasi daugiausiai doksorubicino, o H2 – mažiausiai, tiek ląstelių vienasluoksnyje, tiek sferoiduose. Esant deguonies trūkumui ląstelių aplinkoje (hipoksijoje), doksorubicino transportas sumažėja visose sublinijose lyginant su įprastine deguonies koncentracija (normoksija).

Ugnės Mekionytės magistro baigiamojo darbo pavadinimu „Sunitinibo darinių ir doksorubicino sinergistinio poveikio trejopai neigiamo krūties vėžio ląstelių kultūrose įvertinimas“ mokslinis vadovas: vyr. m. d. Vilma Petrikaitė. Atlikimo vieta: Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Kardiologijos instituto Vaistų taikinių histopatologijos laboratorija. Darbo tikslas – įvertinti sunitinibo darinių ir doksorubicino poveikį žmogaus trejopai neigiamo krūties vėžio ląstelių dvimatėse ir trimatėse kultūrose. Darbo uždaviniai: (1) nustatyti sunitinibo darinių ir doksorubicino derinių poveikį žmogaus krūties vėžio ląstelių gyvybingumui; (2) įvertinti sunitinibo darinių ir doksorubicino derinių poveikį žmogaus krūties vėžio ląstelių migracijai; (3) nustatyti sunitinibo darinių ir doksorubicino derinių poveikį žmogaus krūties vėžio ląstelių sferoiduose. Tyrimo objektas: sunitinibo (SNT) darinių 4001, 4006, 4007, 4008, 4017 ir doksorubicino (DOX) deriniai. Kaip palyginamasis junginys naudotas SNT. Tyrimo metodai: tyrime naudotos žmogaus trejopai neigiamo krūties vėžio ląstelių linijos: MDA-MB-231 ir DOX atspari MDA-MB-231 (MDA-MB-231/DR). Junginių bei jų derinių su DOX citotoksiniam poveikiui nustatyti buvo naudojamas 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromido (MTT) redukcijos metodas. Pagal Hill‘o formulę apskaičiuotos junginių koncentracijos, sukeliančios 50 proc. maksimalaus efekto (EC50). Kombinacijų indeksas (CI) apskaičiuotas remiantis Chou-Talalay metodika. Junginių derinių poveikis ląstelių migracijai įvertintas „žaizdos gijimo“ metodu pagal „žaizdos“ ploto pokytį. Sferoidai formuoti magnetinio 3D biospausdinimo metodu. Derinių poveikis sferoidams įvertintas pagal jų skersmens pokyčius ir jų ląstelių gyvybingumą. Rezultatai. Visi tirti junginiai slopino ląstelių gyvybingumą. Junginys 4001 labiausiai slopino tiek MDA-MB-231, tiek MDA-MB-231/DR ląstelių gyvybingumą (EC50 atitinkamai 105,7 ± 18,5 nM ir 690,3 ± 158,9 nM). Junginys 4001 slopino MDA-MB-231 ląstelių gyvybingumą 39,5 karto labiau nei SNT. Junginys 4001 labiausiai mažino abiejų tirtų ląstelių linijų gyvybingumą derinyje su DOX. Junginių deriniai sinergistinio poveikio MDA-MB-231 linijos ląstelėms neturėjo. Junginių 4001, 4006, 4008, 4017 deriniai su DOX turėjo sinergistinį efektą MDA-MB-231/DR ląstelėms, kai fa > 0,5. SNT bei jo darinio 4001 deriniai su DOX neslopino abiejų ląstelių linijų migracijos labiau nei pavieniai junginiai. Tyrime naudoti junginių deriniai poveikio MDA-MB-231 sferoidams neturėjo. Junginys 4001 ir SNT derinyje su DOX slopino MDA-MB-231/DR sferoidų augimą labiau negu pavieniai junginiai 4001 ir SNT. Išvados. Visi junginiai, išskyrus SNT ir junginį 4007, derinyje su DOX turėjo sinergistinį efektą DOX atsparių trejopai neigiamo vėžio ląstelių gyvybingumui. SNT bei jo darinio 4001 deriniai su DOX nesumažino abiejų ląstelių linijų migracijos labiau nei pavieniai junginiai, tačiau SNT ir DOX derinys veikė efektyviau nei vien DOX. Junginys 4001 ir SNT derinyje su DOX slopino DOX atsparių sferoidų augimą.

U. Žulpaitės magistro baigiamasis darbas ,,Hibridinių lipidinių-polimerinių nanoformuluočių su doksorubicinu aktyvumas ir transportas 2D ir 3D vėžio ląstelių kultūrose“/ mokslinis vadovas prof. V. Petrikaitė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto Vaistų taikinių histopatologijos laboratorija. – Kaunas. Darbo tikslas: Įvertinti hibridinių lipidinių-polimerinių nanoformuluočių su doksorubicinu aktyvumą ir transportą 2D ir 3D vėžio ląstelių kultūrose. Darbo uždaviniai: (1) pagaminti hibridines lipidines polimerines nanoformuluotes su doksorubicinu ir jas charakterizuoti; (2) įvertinti hibridinių lipidinių polimerinių nanoformuluočių poveikį krūties vėžio ląstelių gyvybingumui 2D ir 3D ląstelių kultūrose bei poveikį 3D kultūrų augimui (3) įvertinti hibridinių lipidinių-polimerinių nanoformuluočių transportą į 2D ir 3D krūties vėžio kultūras. Tyrimo objektas: Susintetintos hibridinės lipidinės-polimerinės nanoformuluotės su doksorubicinu ir su arba be peptido, prisijungiančio prie neuropilino-1 receptoriaus. Tyrimo metodai: Nanodalelių sintezei naudotas nanoprecipitacijos metodas, o charakteristinių savybių nustatymui – dinaminis šviesos sklaidos metodas. Doksorubicino įterpimo efektyvumas į nanodaleles nustatytas fluorescencijos metodu. Doksorubicino atpalaidavimo ląstelių terpėje tyrimui naudotas dializės metodas 72 val. laikotarpiu, esant pH 5,5 ir pH 7,4. Nanodalelių poveikis MDA-MB-231 ir PPC-1 (kontrolė) ląstelių gyvybingumui tirtas WST-1 metodu normoksijos ir hipoksijos sąlygomis po 72 val. inkubacijos apskaičiuojant pusinės efektyviosios koncentracijos (EC50) vertes. Po 8 dienų 3D ląstelių kultūrų inkubacijos, nustatytas nanodalelių poveikis jų gyvybingumui WST-1 metodu ir apskaičiuotas sferoidų dydžio pokytis. Nanodalelių transportas į 2D ir 3D ląstelių kultūras vertintas fluorescencinės mikroskopijos metodu. Rezultatai. Pagamintos neigiamą paviršiaus krūvį turinčios nanodalelės, kurių dydis ≤ 200 nm. Didžioji dalis (78 proc.) doksorubicino iš nanodalelių, ląstelių terpėje atsipalaidavo per 30 min., vaistas labiau atpalaiduojamas rūgštinėje terpėje. Nanodalelės su doskorubicinu bei nanodalelės su peptidu ir doksorubicinu pasižymėjo mažesniu MDA-MB-231 2D ląstelių gyvybingumą mažinančiu poveikiu normoksijoje, lyginant su doksorubicinu, tačiau hipoksijoje priešvėžinis aktyvumas nesiskyrė. Abiejų rūšių nanodalelės mažino ląstelių 3D kultūrose gyvybingumą, o nanodalelės su doksorubicinu mažino ir jų augimą. Nanodalelės su doksorubicinu ir nanodalelės su peptidu ir doksorubicinu efektyviau transportuojamos į MDA-MB-231 2D ląstelių branduolius po 4 val. normoksijoje nei doksorubicinas. Nanodalelės su peptidu ir doksorubicinu efektyviausiai transportuojamos į MDA-MB-231 ląstelių 3D kultūras. Išvados. Abiejų rūšių nanodalelės su doksorubicinu mažina 3D kultūrų gyvybingumą ir efektyviau nei doksorubicinas transportuojamos į ląstelių monosluoksnį normoksijoje. Peptido, besijungiančio prie NRP-1 receptoriaus, prijungimas prie nanodalelių, padidina jų transportą į MDA-MB-231 sferoidus.

Vienas reikšmingiausių chemoterapijos efektyvumą ribojančių veiksnių yra nepakankamas vaistų patekimas į navikus, todėl pastaruosius dešimtmečius intensyviai ieškoma būdų, kurie leistų padidinti priešvėžinių junginių skvarbą į vėžio ląsteles. Tam gali būti naudojami tiek cheminiai junginiai, moduliuojantys ekstraląstelinį pH navikuose ar slopinantys ATP skaidančius pernašos baltymus, šalinančius priešvėžinius junginius iš ląstelės, tiek fizikiniai metodai, pavyzdžiui ultragarso taikymas, siekiant suformuoti poras ląstelės membranoje. Šio darbo tikslas – įvertinti transporto į ląstelę moduliatorių (protonų siurblio slopiklių omeprazolo ir lansoprazolo, karboanhidrazių (CA) slopiklių metazolamido ir U 104, P glikoproteino slopiklių silimarino ir kvercetino) ir ultragarso poveikį doksorubicino (DOX) ir pegiliuoto liposominio doksorubicino (PLD) patekimui į vėžio ląstelių kultūras. Šis darbas vienas pirmųjų, kuriame CA slopikliai įvertinti kaip potencialūs DOX ir PLD transporto moduliatoriai ne tik monosluoksniu auginamose ląstelėse, bet ir sferoiduose. Iki šiol su transporto moduliatoriais atlikti tyrimai praplėsti, atliekant eksperimentus skirtingomis sąlygomis – esant skirtingam terpės pH, skirtingai inkubacijos trukmei, imituojant hipoksijos sąlygas. Darbe įvertinta žemo dažnio pulsinio ultragarso įtaka DOX patekimui į ląsteles ir sferoidus taikant jį atskirai ar derinyje su SonoVueTM mikroburbulais.

Darbo tikslas – įvertinti naujų kinazių slopiklių poveikį krūties vėžio ląstelių migracijai normoksijos ir hipoksijos sąlygomis. Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti naujų kinazių slopiklių poveikį krūties vėžio ląstelių gyvybingumui normoksijos ir hipoksijos sąlygomis.
2. Ištirti naujų kinazių slopiklių poveikį krūties vėžio ląstelių migracijai „žaizdos gijimo“ metodu normoksijos ir hipoksijos sąlygomis.
3. Ištirti naujų kinazių slopiklių poveikį krūties vėžio ląstelių migracijai vienos ląstelės sekimo metodu normoksijos ir hipoksijos sąlygomis.
4. Ištirti naujų kinazių slopiklių poveikį krūties vėžio ląstelių migracijai iš sferoidų. Tyrimo objektas. Nauji kinazių slopikliai, susintetinti Kaljario universitete, Italijoje, kurie yra panašūs į klinikinėje praktikoje naudojamą vaistinį junginį sunitinibą. Tyrimo metodai. Šiame darbe tirtas naujų kinazių slopiklių poveikis žmogaus trejopai neigiamo krūties vėžio linijos MDA-MB-231 ląstelių migracijai. Kinazių slopiklių poveikis ląstelių gyvybingumui buvo nustatytas MTT redukcijos metodu po 72 h inkubacijos, apskaičiuojant pusinės efektyviosios koncentracijos (EC50) vertes. Kinazių slopiklių poveikis ląstelių migracijai buvo įvertintas 2D ląstelių kultūrose, taikant „žaizdos gijimo“ ir vienos ląstelės sekimo metodus. MDA-MB-231 linijos ląstelių sferoidai suformuoti taikant magnetinį 3D biospausdinimo metodą. Kinazių slopiklių poveikis ląstelių migracijai iš sferoidų buvo įvertintas kas 24 h matuojant ląstelių migracijos atstumą. Hipoksijos sąlygos imituotos naudojant 200 μM koncentracijos kobalto chloridą. Rezultatai. Didžiausiu gyvybingumą slopinančiu poveikiu normoksijos ir hipoksijos sąlygomis žmogaus trejopai neigiamo krūties vėžio linijos ląstelėms pasižymėjo kinazių slopiklis 1 (EC50 vertės buvo atitinkamai 73,6 ± 5,8 nM ir 90,2 ± 10,0 nM normoksijos ir hipoksijos sąlygomis). Visi tirti junginiai stipriau slopino ląstelių gyvybingumą, lyginant su sunitinibu. Hipoksijos sąlygomis junginiai 1, 6 ir sunitinibas “žaizdos gijimo” metodu statistiškai reikšmingai slopino MDA-MB-231 ląstelių migraciją. Normoksijos sąlygomis nė vienas iš tirtų junginių statistiškai reikšmingai neslopino migracijos. Vienos ląstelės sekimo metodu tiek normoksijos, tiek hipoksijos sąlygomis junginys 6 ir sunitinibas statistiškai reikšmingai slopino MDA-MB-231 ląstelių migraciją. MDA-MB-231 ląstelių migraciją iš sferoidų statistiškai reikšmingai slopino kinazių slopikliai 1, 6 ir sunitinibas. Išvados. Nauji kinazių slopikliai, ypač 1 ir 6, pasižymi trejopai neigiamo krūties vėžio MDA-MB-231 linijos migraciją slopinančiu poveikiu, todėl yra perspektyvūs tolimesniems tyrimams, ieškant naujų vaistų nuo vėžio metastazių.

Darbo tikslas - įvertinti sunitinibo analogų priešvėžinį aktyvumą smegenų vėžio modeliuose in vitro. Darbo uždaviniai: nustatyti sunitinibo analogų poveikį smegenų vėžio ląstelių gyvybingumui; ištirti sunitinibo analogų poveikį smegenų vėžio ląstelių migracijai; ištirti sunitinibo analogų aktyvumą smegenų vėžio ląstelių trimatėse kultūrose. Tyrimo objektas: 16 sunitinibo analogų, susintetintų Kaljario universitete, Italijoje. Tyrimo metodai: Šiame darbe tiriamas sunitinibo ir jo analogų poveikis žmogaus smegenų vėžio ląstelių linijoms U-87MG ir A172. Poveikis ląstelių gyvybingumui nustatytas MTT redukcijos metodu. Gyvybingų ląstelių kiekis po 72 val. inkubacijos vertintas spektrofotometriškai, apskaičiuotos pusinės efektyviosios koncentracijos vertės. Junginių poveikis ląstelių migracijai įvertintas taikant vienos ląstelės sekimo metodą, nustatant ląstelių koordinates ir apskaičiuojant vidutinį ląstelės judėjimo greitį. Poveikis trimatėms ląstelių kultūroms įvertintas apskaičiuojant sferoidų dydžio pokytį. Tyrimams naudoti sferoidai suformuoti kabančio lašo metodu. Rezultatai: Smegenų vėžio U-87MG ir A172 ląstelių gyvybingumą labiausiai slopino junginys 1. Junginys 1 turėjo stipriausią poveikį U-87MG ląstelių migracijai, o junginys 7 – A172 linijos ląstelių migracijai. Junginių poveikio trimatėms ląstelių kultūroms rezultatai parodė, kad tik sunitinibas statistiškai reikšmingai slopino U-87MG ląstelių sferoidų augimą 100 nM ir 500 nM koncentracijomis. Junginys 7 slopino A172 ląstelių sferoidų augimą abejomis koncentracijomis, panašiai kaip sunitinibas. Išvados: Sunitinibo analogai pasižymi priešvėžiniu aktyvumu smegenų vėžio U-87MG ir A172 ląstelių linijose. Junginiai labiau slopina ląstelių gyvybingumą ir migraciją, tačiau nei vienas nepasižymi stipresniu poveikiu trimačių ląstelių kultūroms nei sunitinibas.