MF VSI Klinikinės ir molekulinės gastroenterologijos laboratorija (04.06.02)

Uždegiminių žarnyno ligų (UŽL) grupei priskiriamos dvi ligos: Krono liga ir opinis kolitas. Sergant šiomis ligomis nustatomi viršinamojo trakto pažeidimai, kuriuos sąlygoja uždegiminių procesų vystymasis žarnyne. Augalinės kilmės polifenoliai, sinergiškai veikdami kartu su žarnyno mikrobiota, lemia uždegiminių procesų slopinimą ir mažina UŽL simptomus. Baigiamojo bakalauro darbo tikslas – naudojant žarnyno epitelio monokultūros uždegimo modelį nustatyti polifenolinių junginių – epigalokatechino galato (EGCG), elago rūgšties (EA) ir urolitino D (UroD) – įtaką uždegimo moduliavimui. Tikslui pasiekti buvo išsikelti šie darbo uždaviniai:

1. Nustatyti pasirinktų polifenolinių junginių poveikį ląstelių streso lygiui, įvertinant streso baltymą koduojančio geno HSPB1 raišką.
2. Nustatyti pasirinktų polifenolinių junginių įtaką ląstelių barjero funkcijai, įvertinant glaudžiųjų jungčių baltymus koduojančių genų ZO-1 ir OCLN raišką.
3. Nustatyti pasirinktų polifenolinių junginių poveikį citokinus ir chemokinus koduojančių genų CXCL9, IL-6 ir IL-1B raiškai. Tyrimo metu žarnyno epitelio uždegimui modeliuoti pasitelkta Caco-2 ląstelių kultūra. Eksperimento metu ląstelės veiktos: (I) polifenoliniais junginiais (EA, UroD bei EGCG); (II) citokinais (IFNγ ir TNFα); (III) polifenoliais bei citokinais; (IV) neveiktos ląstelės naudotos kaip kontrolė. Po stimuliavimo medžiagomis iš Caco-2 ląstelių išgryninta RNR, atlikta kopijinės DNR sintezė bei vykdyta tikro laiko polimerazės grandininė reakcija HSPB1, ZO-1, OCLN, CXCL9, IL-6, IL-1B genų raiškai įvertinti. Gauti rezultatai parodė, kad žarnyno epitelio uždegimo metu UroD lemia HSPB1 geno raiškos sumažėjimą ir OCLN raiškos padidėjimą. EGCG skatina ZO-1 ir OCLN genų raišką, tačiau slopina IL-6 ir CXCL9. EA sumažina tiek IL-6, tiek OCLN genų raišką. Apibendrinant, polifenoliniai junginiai pasižymi skirtingu poveikiu HSPB1, ZO-1, OCLN, CXCL9, IL-6, IL-1B genų raiškai esant žarnyno epitelio uždegimui. Tyrime didžiausiosiomis modeliuojančiomis savybėmis genetiniame lygmenyje pasižymėjo EGCG, kuris sąlygojo net keturių genų raiškos pokyčius.

Baigiamojo magistro darbo autorius: Kornelija Plingytė Tema: Žarnyno organoido ir imuninių ląstelių mišrios kultūros modelio vystymas ir charakterizavimas Mokslinis vadovas: dr. I. Aleknavičienė Atlikimo vieta: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Medicinos fakultetas, Virškinimo sistemos tyrimų institutas, klinikinės ir molekulinės gastroenterologijos laboratorija Santraukos turinys: Šio baigiamojo magistro darbo tikslas buvo sukurti žarnyno ex vivo tyrimų modelį iš žmogaus storosios žarnos epitelinių ląstelių ir makrofagų bei atlikti išsamų jo apibūdinimą. Tikslui pasiekti buvo išsikelti darbo uždaviniai:

1. Įvertinti mišrios kultūros epitelinio komponento – iš storosios žarnos organoidų sugeneruoto monosluoksnio – vientisumą, integralumą ir ląstelių kompoziciją.
2. Charakterizuoti mišrios kultūros imuninio komponento – iš periferinio kraujo monocitų diferencijuotų makrofagų – paviršinių žymenų raišką.
3. Įvertinti stimuliacijos INF-γ ir IL-22 poveikį mišrios kultūros žarnyno epitelinių ląstelių ir makrofagų citokinų sekrecijai. Tyrimo metu iš trimačių storosios žarnos organoidų sugeneruotas epitelinis monosluoksnis buvo detaliai charakterizuotas, paviršiaus padengimą ir ląstelinę kompoziciją vertinant šviesinės ir imunofluorescencinės mikroskopijos metodais, o epitelio pralaidumą – registruojant transepitelinę elektrinę varžą. Paraleliai periferinio kraujo monocitai buvo diferencijuoti į makrofagus, tėkmės citometrijos metodu įvertintas šių imuninių ląstelių paviršinių žymenų raiškos pasikeitimas. Toliau specialiuose įdėkluose sugeneruota kompleksinė storosios žarnos epitelinių ląstelių ir makrofagų sistema. Ji galiausiai stimuliuota egzogeniniais INF-γ ir IL-22 baltymais, ir tėkmės citometrijos metodu įvertinti skirtingų ląstelių sekretuojamų uždegiminių citokinų ir chemokinų kiekybiniai pokyčiai. Tyrimo objektas buvo žmogaus žarnyno kultūra, sukurta iš storosios žarnos epitelinių ląstelių ir makrofagų. Gauti rezultatai parodė, kad epiteliniai monosluoksniai tolygiai padengia augimo paviršių, turi proliferuojančias ir specializuotas žarnyno ląsteles (Gobleto, enteroendokrinines, kolonocitus) bei aiškiai išreikštą tarpląstelinių glaudžiųjų jungčių tinklą. Tolesnė imuninių ląstelių analizė, nukreipta į monocitų ir makrofagų paviršinių žymenų raišką, atskleidė, kad pasirinktas kultivavimo protokolas įgalina iš periferinio kraujo išskirtų monocitų diferenciaciją į makrofagus. Galiausiai, įvertinta, kad stimuliacija egzogeniniais baltymais IFN-y ir IL-22 mišrioje ląstelių kultūroje sąlygoja reikšmingai pakitusią uždegiminių citokinų (IL-12p70 ir IL-23) sekreciją iš storosios žarnos epitelinių ląstelių. Taigi, sugeneruota eksperimentinė sistema įvertinta kaip reprezentatyvus mišrios storosios žarnos organoido ir imuninio faktoriaus kultūros modelis, kuris toliau gali būti panaudotas daugiaveiksnių žarnyno ligų tyrimams in vitro.

Darbo tikslas: Nustatyti mikobiotos pakitimus kepenų cirozės pacientų išmatų mėginiuose Darbo uždaviniai:

1. Įvertinti preanalitinių veiksnių įtaką išmatų mikobiotos profiliui.
2. Nustatyti mikobiotos profilio pokyčius lyginant kepenų ciroze sergančių pacientų išmatų mėginius su kontroline grupe.
3. Nustatyti kepenų ciroze sergančių pacientų išmatų mėginių mikobiotos profilio sąsają su klinikiniais požymiais. Darbo objektas ir metodai. Retrospektyvinis rinkimo metodas, kurio metu buvo analizuojama preanalitinių veiksnių įtaką išmatų mikobiotos profiliui bei kepenų ciroze sergančių asmenų ir kontrolės (sveikų asmenų) grupių išmatos. Buvo atliekamas DNR skyrimas, nukleorūgščių kiekio ir kokybės įvertinimas, grybų ITS2 regiono PGR amplifikacija, sekoskaita, bioinformatinė duomenų analizė. Tyrimo rezultatai. Atliekant mikobiotos tyrimus ir skiriant DNR iš išmatų galima pasirinkti bet kurį iš šių skyrimo rinkinių: Qiamp Fast DNA Stool Mini, Purelink Microbiome DNA Stool Purification Kit, AllPrep Power Fecal DNA/RNA, AllPrep Fungal DNA/RNA/Protein, tarp šių rinkinių nebuvo reikšmingo skirtumo bei fermento lizocimo koncentracija 0,2 mg/ml neturėjo įtakos nustatytų po sekoskaitos grybų tiek gausumui, tiek įvairovei. Atlikus alfa ir beta įvairovės analizę lyginant KC ir kontrolės grupes, buvo nustatytas statistiškai reikšmingų skirtumai tarp tiriamųjų grupių. Pagal alfa įvairovės indeksus mikobiota KC pacientų, kurie yra priklausomi nuo alkoholio, turėjo statistiškai reikšmingai aukštesnius rezultatus nei HCV infekuoti. Sunkesne KC sergantys pacientai (MELD ≥ 15, Child-Pugh klasė C) pasižymėjo padidėjusią alfa įvairove. Analizuojant beta įvairovę KC grupės klinikinių duomenų buvo nustatytas Candida genties dominavimas, kai MELD ≥ 15, Child-Pugh balų sistemoje nustatyta B klasė ir etiologija susijusi su alkoholiu. Išvados:
4. Tirti preanalitiniai veiksniai (DNR skyrimo rinkinys ir inkubavimas su lizocimu) neturėjo įtakos išmatų mikobiotos profiliui.
5. Pacientų, sergančių kepenų ciroze, mikobiotos profilis pasižymėjo žemesniu grybų gausumu palyginus su kontroliniais asmenimis. Kepenų ciroze sergančiųjų grupėje buvo nustatytas 5 gausumo sumažėjimas Eurotiomycetes, Ustilaginomycetes, Aspergillaceae, Saccharomycetaceae, Ustilaginaceae, Moesziomyces, Penicillium, Saccharomyces ir Eurotiales grybų taksonominėse grupėse bei padidėjimas Saccharomycetales fam Incertae sedis, Candida ir Malasseziales grybų taksonominėse grupėse.
6. Kepenų ciroze sergantiems pacientams, kurių MELD balas ≥ 15 ir Child-Pugh klasė C, nustatyta padidėjusi grybų įvairovė ir gausumas. Candida genties grybo kiekio padidėjimas buvo susietas su MELD rodikliu ≥ 15, alkoholine ligos etiologija ir B klase pagal Child-Pugh balų sistemą.

Tyrimo tikslas: Įvertinti šeimininko ir žarnyno bakterijų sąveiką, vykstančią per mikroRNR, storosios žarnos vėžio atveju. Tyrimo uždaviniai:

1. Nustatyti mikrobiomo profilio skirtumus tarp storojo žarnyno vėžiu sergančių pacientų ir sveikų individų storojo žarnyno audiniuose.
2. Identifikuoti kolorektalinio vėžio metu storosios žarnos audinyje labiausiai dereguliuotas mikroRNR tolesnei in silico mikrobiomo ir miRNR sąveikos analizei.
3. Identifikuoti sąsajas tarp mikrobiomo bei mikroRNR storojo žarnyno vėžiu sergančiųjų pacientų ir sveikų individų grupėse. Tyrimo objektas: storosios žarnos vėžiu sergančiųjų bei kontrolinės grupės (sveikų asmenų) storosios žarnos audinių ėminai.

Bakalauro baigiamojo darbo tikslas: Įvertinti lipopolischarido įtaką citokinus koduojančių genų raiškai storosios žarnos ląstelėse. Šiam tikslui įgyvendinti buvo iškelti du uždaviniai:

1. Nustatyti Toll baltymo 4 receptoriaus (TLR4) geno raiškos pokyčius po 24 val. stimuliacijos 1 ir 10 μg/ml Salmonella enterica lipopolisacharido tirpalu storosios žarnos epitelinėse HCoEpic ir adenokarcinomos HCT116 ląstelėse, trijuose laiko taškuose (po 24, 48 ir 72 val.)
2. Nustatyti citokinų TNF-alfa, IL-beta, IL-6, IL-10 ir IL-17A genų raiškos pokyčius storosios žarnos epitelinėse HCoEpic ir adenokarcinomos HCT116 ląstelėse po poveikio 1 ug/ml ir 10 ug/ml Salmonella enterica lipopolisacharido tirpalu, trijuose laiko taškuose (po 24, 48 ir 72 val.) Tyrimo objektas – citokinų genų raiškos pokyčiai in vitro po lipopolisacharido poveikio. Šiame darbe genų raiška buvo atlikta kiekybinio TL-PGR metodu naudojant Sybrgreen pradmenis. Atlikus genų raiškos analizę Livak metodu buvo nustatyta, kad Toll baltymo 4 receptoriaus (TLR4) geno raiška po 24 val. stimuliacijos 10 μg/ml lipopolisacharido tirpalu ląstelėse HCoEpiC padidėjo po 72 val. Citokino TNF-α geno raiška padidėjo HCT116 ląstelėse po 24 val. stimuliacijos 1 μg/ml lipopolisacharido tirpalu. IL-10 geno raiška padidėjo HCT116 ląstelėse po 24 val. stimuliacijos 1 μg/ml ir po 48 ir 72 val. stimuliacijos 10 μg/ml lipopolisacharido tirpalu, IL-17A geno raiška padidėjo HCT116 ląstelėse po 72 val. paveikus 1 μg/ml ir po 24val. ir 72 val. paveikus 10 μg/ml lipopolisacharido tirpalu, IL-6 ir IL-beta genų raiškai stimuliacija įtakos neturėjo nei 1 μg/ml nei 10 μg/ml lipopolisacharido tirpalas. Apibendrinant galima teigti, kad 24 val. stimuliacija 1 ir 10 μg/ml Salmonella enterica lipopolisacharido tirpalu buvo nepakankama, kad reikšmingai pasikeistų citokinų (TNF-alfa, IL-beta, IL-6, IL-10 ir IL-17) genų raiška storosios žarnos ląstelėse. Tačiau rezultatų patvirtinimui turi būti atlikta daugiau tyrimų.

Santraukos turinys: Šio bakalaurinio darbo tikslas buvo išvystyti žarnyno organoido, sugeneruoto iš sergančiųjų opiniu kolitu ir sveikų individų žarnyno kamieninių ląstelių, ir bakterijų kultūros modelį ir įvertinti jo tinkamumą žarnyno epitelio ir mikroorganizmų tarpusavio sąveikos tyrimams in vitro. Šiam tikslui įgyvendinti buvo iškelti keturi uždaviniai:

1. Charakterizuoti opinio kolito pacientų ir kontrolinės grupės tiriamųjų diferencijuotas storosios žarnos organoido monosluoksnio kultūras, mikroskopiškai įvertinant jų ląstelinę kompoziciją ir glaudžiųjų jungčių susiformavimą.
2. Įvertinti opinio kolito pacientų ir kontrolinės grupės tiriamųjų storosios žarnos epitelinių ląstelių glaudžiųjų jungčių baltymą (ZO-1) koduojančio geno raiškos pokyčius po kontakto su Escherichia coli ir Phocaeicola vulgatus bakterijomis.
3. Įvertinti kontakto su Escherichia coli ir Phocaeicola vulgatus bakterijomis įtaką opinio kolito pacientų ir kontrolinės grupės tiriamųjų storosios žarnos epitelinių ląstelių streso baltymus (HSPA1A ir HSPB1) koduojančių genų raiškai.
4. Įvertinti Escherichia coli ir Phocaeicola vulgatus bakterijų poveikį opinio kolito pacientų ir kontrolinės grupės tiriamųjų storosios žarnos epitelinių ląstelių Toll-tipo receptorių (TLR4) koduojančio geno raiškai.

Tyrimo metu suformuotos 2D žarnyno epitelinių monosluoksnių kultūros imunofluorescencijos metodu buvo detaliai charakterizuotos, įvertinant sukurto modelio atitikimą storosios žarnos struktūrai in vivo. Vėliau į kultūrą buvo įjungtas bakterinis komponentas. Visuminė epitelinių ląstelių RNR išgryninta silikagelio kolonėlių principu, kopijinė DNR susintetinta naudojant atsitiktinius atvirkštinės transkripcijos pradmenis. Pasirinktų genų raiška įvertinta kiekybinės tikrojo laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu, naudojant genams specifinius pradmenis, raiškos rezultatai įvertinti 2-ΔΔCt metodu. Statistinė duomenų analizė ir rezultatų vizualizacija atlikta su R studio. Tyrimo objektas buvo žarnyno kultūra, sukurta iš žmogaus storosios žarnos epitelinių ląstelių ir bakterijų.

Tyrimo rezultatai parodė, kad iš trimačių storosios žarnos organoidų suformuoti ir diferencijuoti opinio kolito ir kontrolinės grupės epitelio monosluoksniai ekspresuoja glaudžiųjų jungčių baltymą ir formuoja vientisą epitelinį paviršių, sudarytą iš proliferuojančių ir specializuotų (Gobleto, enteroendokrininių, kolonocitų) storosios žarnos epitelinių ląstelių, kurių kompozicija atspindi in vivo storosios žarnos epitelio struktūrą. Kiekybinė raiškos analizė atskleidė genų, dalyvaujančių esminiuose bakterijų atpažinimo ar poveikio epitelinėms ląstelėms procesuose, raiškos pokyčių tendencijas (nors ir nepasiekusias statistinio reikšmingumo). Nustatyta, kad abiejų tiriamųjų grupių pacientų storosios žarnos epitelinių ląstelių ZO-1 geno raiška buvo linkusi mažėti, kontaktuojant su E. coli ar P. vulgatus bakterijomis. Monosluoksnius sudarančių ląstelių poveikis tirtomis bakterijomis sąlygojo HSPA1A ir TLR4 genų raiškos padidėjimo tendenciją kontrolinių ir opiniu kolitu sergančių pacientų grupėse, o HSPB1 geno raiškoje fiksuoti skirtingi bakterijų efektai, priklausomai nuo tiriamosios pacientų grupės. Apibendrinant, sugeneruoti žarnyno organoidų ir bakterijų kultūrų modeliai morfologiniu lygmeniu atkartojo in vivo storosios žarnos epitelį ir molekuliniu lygmeniu pademonstravo reaktyvumą į dvi skirtingas komensalinių žarnyno bakterijų rūšis. Šie radiniai leido įvertinti sugeneruotus in vitro modelius kaip tinkamas eksperimentines sistemas šeimininko ir bakterijų tarpusavio sąveikos tyrimams.