MF VSI Chirurginės gastroenterologijos laboratorija (04.06.01)

Šio bakalaurinio tyrimo metu buvo siekiama ištirti AHR funkcinės moduliacijos poveikį PKVL priešnavikinėms funkcijoms. Tam pasiekti buvo iškelti tyrimo uždaviniai: 1) įvertinti AHR moduliacijos efektyvumą, per AHR bei CYP1A1 genų raiškos pokyčius; 2) Įvertinti moduliuotų PKVL ląstelių uždegiminius ir priešnavikinius pokyčius tiriant IL-1B, IL-4, IL-6, IL-10, PD-1 ir PDL-1 genų raišką ir sintezę. 3) Įvertinti moduliuotų PKVL ląstelių funkcinį aktyvumą, tiriant metabolinį aktyvumą, NO ir ROS produkciją. Tyrimas atliekamas išskiriant PKVL iš kasos vėžiu sergančių pacientų kraujo. Išskirtos ląstelės 24h veikiamos AHR moduliatoriais. Po moduliacijos ROS, NO bei metaboliniai pokyčiai buvo vertinami tą pačią dieną, likę PKVL mėginiai krioprezervuojami. Atlikta genų raiškos analizė iš moduliuotų PKVL: išskirta iRNR, konvertuojama į kDNR, o pokyčiai vertinami TL-PGR metodu. Iš moduliacijos terpės ELISA metodu ištirti tikslinių laisvų baltymų kiekio pokyčiai. Statistinei analizei naudotas ,,Mann-Whitney U“ testas. Rezultatai parodė CYP1A1 geno raiškos didėjimo tendenciją po AHR aktyvacijos. O inhibavus – CYP1A1 raiška mažėjo. Aktyvuoto AHR PKVL grupėje statistiškai patikimai sumažėjo IL-10 raiška, taip pat pastebėta IL-6 mažėjimo bei PD-L1 didėjimo tendencijos. Inhibuoto AHR grupėje išaugo IL-6, IL-10 bei PD-L1 raiškų tendencijos. IL-10 laisvo baltymo analizės duomenys tendencingai atkartojo IL-10 geno raiškos rezultatus. Po AHR inhibicijos, sumažėjo laisvo PD-1 ir padidėjo laisvo PD-L1 tendencijos. AHR aktyvacija skatino reikšmingą ROS produkcijos didėjimą, o AHR inhibicija – reikšmingą mažėjimą. AHR aktyvacija parodė tendencingą metabolinio aktyvumo kitimą. Vis dėlto AHR moduliacija PKVL ląstelėse buvo dalinai efektyvi. IL-6 bei IL-10 raiškos mažėjimas po AHR aktyvacijos, gali būti naudingas pacientams. AHR inhibicija slopina PD-1, bet skatina PD-L1 sintezę, ši informacija gali prisidėti prie imunoterapinių gydymo strategijų gerinimo. Po AHR aktyvacijos stebima PKVL metabolinio aktyvumo didėjimo tendencija ir reikšmingai padidėjusi ROS produkcija. Tyrimas atskleidė, kad AHR moduliacija daro poveikį PKVL genų raiškai ir metaboliniams procesams, tačiau tam, kad būtų galima išsamiai įvertinti šio kelio reikšmę imuninei sistemai ir terapiniam potencialui, būtini tolesni tyrimai su didesne imtimi ir pacientų grupavimu.

Kasos vėžys yra itin agresyvaus tipo onkologinis susirgimas, pasižymintis dideliais mirtingumo rodikliais. Vienas iš veiksnių, lemiančių mažą pacientų išgyvenamumą, yra naviko atsparumas šiuolaikinėms chemoterapijoms. Ieškant būdų pagerinti chemoterapijų veiksmingumą ir pacientų išgyvenamumo galimybes, kritiškai svarbu tirti mechanizmus, kurie, tikėtina, turi įtakos atsparumo išsivystymui. Šio baigiamojo darbo tikslas buvo nustatyti AHR baltymo moduliacijos įtaką su gemcitabino veiksmingumu susijusių genų ir baltymų raiškai. Užsibrėžiame darbo uždavinius: 1) nustatyti AHR aktyvatoriaus ir inhibitoriaus dozes, kurios veiksmingai aktyvuoja arba inhibuoja AHR baltymą; 2) įvertinti AHR baltymo moduliacijos įtaką ELAVL1 ir dCK iRNR, bei baltymų sintezei kasos vėžio ląstelėse; 3) įvertinti AHR baltymo moduliacijos įtaką ELAVL1 baltymo lokalizacijai ląstelėje. Realizuojant šį tikslą, naudotos dvi kultūrinės kasos navikinės ląstelių linijos. AHR agonisto ir antagonisto eksperimentinės dozės kiekvienai ląstelių linijai nustatytos pagal resazurino metabolizmo metodiką. Iš nustatytomis dozėmis veiktų ląstelių išskirta iRNR ir baltymai. Genų raiškos pokyčiai vertinti TL-PGR, o baltymų Western Blot analize. ELAVL1 lokalizacijos pokyčiai nustatyti imunocitofluorescencine mikroskopija. AHR funkcinė moduliacija neturėjo įtakos tirtų genų transkripcijai, tačiau stebėti reikšmingi baltymų kiekybiniai pokyčiai. AHR slopinimas lėmė AHR ir dCK baltymų raiškos padidėjimą abejose ląstelių linijose, bei ELAVL1 raiškos padidėjimą Su.86.86 linijoje. Tuo tarpu, AHR aktyvacija sumažino tik AHR baltymo raišką. Imunocitofluorescencine mikroskopija nustatėme, kad AHR aktyvacija mažino citoplazminio ELAVL1 kiekį, o slopinimas didino. Apibendrinus šiuos rezultatus, galime teigti, kad AHR slopinimas teoriškai didina kasos navikinių ląstelių jautrumą gemcitabinui, didinant dCK baltymo transliaciją per ELAVL1 medijuojamą iRNR stabilizaciją. Remiantis tuo, AHR moduliacija gali būti perspektyvi gemcitabino terapijos modifikavimo ir tobulinimo kryptis.

Darbo tikslas: Įvertinti gemcitabino, gauromečio ekstrakto bei jų kombinacijų poveikį kasos vežinių ląstelių metabolizmui ir proliferacijai, in vitro. Darbo uždaviniai:

1. Įvertinti gemcitabino poveikį vėžio ląstelių metabolizmui bei proliferacijai;
2. Įvertinti gauromečio ekstrakto poveikį kasos vežio ląstelių metabolizmui bei proliferacijai;
3. Įvertinti skirtingų gemcitabino ir gauromečio ekstrakto kombinacijų poveikį kasos vėžio ląstelėms bei jų kombinacinį efektyvumą. Tyrimo objektas: Iš ATCC gautos žmogaus kasos latakų epitelinės adenocarcinomos ląstelių linija MIA PaCa-2. Metodika: Kasos vėžinės ląstelės buvo veikiamos skirtingų koncentracijų gemcitabino tirpalu, gauromečio ekstraktu ir jų skirtingų koncentracijų kombinacijomis. Inkubacinis periodas bei laikymo salygos : 24 valandos ir 37°C, 5 proc CO2. Ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas MTT metodu. Lastelių proliferaciją/kolonijų susidarymas buvo įvertinta naudojant šešių šulinėlių plokšteles ir vertinant pagal turimas kontrolines vertes. Rezultatai: Nustatyta gemcitabino (1040nM) ir siauralapio gauromečio (1.16mg/ml) koncentracija kuri slopina kasos vežinių ląstelių gyvybingumą 50 proc. Vertinant ilgalaikį nustatytų dozių poveikį ląstelių kolonijų formavimui, nustatyta, kad tiek gemcitabinas, tiek gaurometis ląsteles veikia citotoksiškai, šis efektas ilgalaikis ir negryžtamas. Tuo tarpu, kombinuotas gauromečio ir gemcitabino poveikis neturi reikšmingų rezultatų kasos vėžinių ląstelių gyvybingumui, lyginant su pavieniais veikliųjų medžiagų poveikiais. Išvados: Galima teigti, kad gemcitabinas ir siauralapis gaurometis neturi reikšmingo kombinuoto poveikio žmogaus kasos latakų epitelinės adenocarcinomos ląstelių linijai MIA PaCa-2. Tačiau, pavieniai gemcitabino ir siauralapio gauromečio poveikiai pasižymi stipriu ląstelių gyvybingumo ir ląstelių proliferacijos slopinimu.

Santraukos turinys: Šio tyrimo tikslas buvo įvertinti už epitelinę-mezenchiminę transformaciją atsakingų molekulių ir ELAVL1 geno raišką bei pokyčius kasos vėžiniuose audiniuose. Šiam tikslui pasiekti buvo iškelti šie uždaviniai: 1) įvertinti ZEB1, ZEB2, SNAI1, SNAI2, TWIST ir ELAVL1 genų raišką sveikuose ir vėžiniuose kasos audiniuose; 2) įvertinti ZEB1, ZEB2, SNAIL, SLUG, TWIST ir ELAVL1 geno koduojamą HuR baltymo kiekį sveikuose ir vėžiniuose kasos audiniuose; 3) atlikti gautų duomenų statistinę analizę, išskirstant pacientus į grupes pagal didesnę ir mažesnę ZEB1 geno raišką. Iš kasos pooperacinių sveikų (n=51) ir vėžinių (n=67) audinių buvo išskirta iRNR ir baltymai. Išskirta iRNR buvo konvertuota į kDNR, o raiškos pokyčiai įvertinti TL-PGR metodu. Baltymo kiekis įvertintas „Western Blot“ metodu. Statistinė analizė apskaičiuota naudojant Mann-Whitney U, Wilcoxon ir Kaplan-Meier testus. Atlikus tyrimą buvo nustatyta, jog bendroje kasos vėžiu sergančių bei tiriamųjų pacientų populiacijose ZEB1, ZEB2, SNAI1, SNAI2 ir TWIST reliatyvios iRNR raiškos medianos buvo statistiškai reikšmingai sumažėjusios vėžiniame audinyje (p<0,05). Palyginus to pačio paciento sveiką ir vėžinį audinius (n=46), statistiškai patikimai skyrėsi ZEB2 ir TWIST genų raiškos (p<0,05). Nepaisant mažesnių vėžinių audinių EMT-TFs ir ELAVL1 medianų, 22 iš 46 pacientų išsiskyrė didesne EMT-TFs ir ELAVL1 genų raiška. Atlikus baltymų analizę, gauti rezultatai rodo, kad tiriamųjų pacientų (n=4) SNAIL/SLUG, ZEB1 ir ZEB2 baltymų kiekiai buvo padidėję vėžiniame audinyje. Kadangi, ZEB1 genas yra siejamas su metastazėmis ir prasta pacientų prognoze, tiriamieji pacientai buvo išskirstyti į dvi grupes: sumažėjusias ir padidėjusias reliatyvias ZEB1 iRNR raiškas. Pacientai su didesne ZEB1 geno raiška, gyveno statistiškai reikšmingai 45 mėn. trumpiau nei pacientai turintys sumažėjusią ZEB1 raišką vėžiniame audinyje (p<0,05). Taip pat nustatyta vidutiniškai neigiama, statistiškai reikšminga koreliacija tarp TWIST raiškos ir pacientų išgyvenamumo (r=-0,41). Apibendrinant duomenis, vėžiniame audinyje nustatyta sumažėjusi EMT-TFs ir ELAVL1 iRNR raiška lyginant su sveiku audiniu. Šis sumažėjimas gali būti susijęs su naviko heterogeniškumu ar ankstyva vėžio stadija. Vėžiniuose audiniuose SNAIL/SLUG, ZEB1 ir ZEB2 baltymo kiekiai buvo padidėję, dėl galimai vykstančios potranskripcinės reguliacijos. Buvo nustatyta, kad pacientai su didesne ZEB1 ir TWIST geno raiška išgyveno atitinkamai vidutiniškai 45 mėn., ir 10 mėn. trumpiau nei pacientai su sumažėjusia šių genų raiška.