Stankevičius, Arūnas

Šio darbo tikslas buvo molekuliniais metodais nustatyti šunų kraujo prisisiurbusių erkių užkrėstumą B. canis ir erkinio encefalito virusu (EEV), taip pat babezioze sirgusių šunų užkrėstumą EEV bei įvertinti B. canis ir B. canis bei EEV užsikrėtusių šunų grupėse vyraujančius simptomus ir kraujo morfologinio, biocheminio ir C reaktyvaus baltymo (CRB) tyrimų rezultatus. Iš viso buvo ištirta 51 babezioze sirgęs šuo ir 53 šunų kraujo prisisiurbusios erkės. Tyrimo metu buvo surinkta šunų anamnezė, atliktas klinikinis tyrimas, atlikti kraujo morfologinis, biocheminis, CRB ir kraujo tepinėlio mikroskopinis tyrimai, nuo šunų nurinktos kraujo prisisiurbę erkės. Šunų kraujo mėginiai bei erkės buvo tiriami molekuliniais metodais (PGR ir AT-PGR), siekiant nustatyti B. canis ir EEV patogenus. Nustatyta, kad daugiausia nuo šunų surinktų erkių priklausė I. ricinus rūšiai (n = 37), mažesnę dalį sudarė D. reticulatus (n = 16). Tyrime B. canis bei mišri B. canis ir EEV infekcija dažniau nustatyta D. reticulatus erkėse (p < 0,05), o EEV dažniau aptiktas I. ricinus erkėse (p > 0,05). Mišri B. canis ir EEV infekcija buvo diagnozuota 19,6 proc. babezioze sirgusių šunų (10/51). Lyginant tik B. canis infekuotus šunis su mišria B. canis ir EEV infekcija sirgusiais šunimis nustatyta, kad dažniau tik babezioze sirgusiems šunims pasireiškė apetito stoka (p < 0,05), o kitų simptomų dažnis tarp grupių reikšmingai nesiskyrė. Abiejose grupėse nustatytas HCT, LYM, PLT, PCT rodiklių sumažėjimas bei MPV rodiklio padidėjimas virš fiziologinės normos ribos. WBC mediana tik babezioze sirgusių šunų grupėje buvo didesnė nei mišria infekcija sirgusių šunų grupėje (p < 0,05). Abiejose grupėse biocheminių kraujo rodiklių medianos išliko fiziologinės normos ribose, o CRB koncentracija kraujyje buvo padidėjusi iki 126,8 ± 62,5 mg/L.

Erkinis encefalitas (EE) – tai virusinė infekcija, kurią perneša erkės, o jos plitimas tarp gyvūnų, ypač šunų, vis dar nėra išsamiai ištirtas. Šio magistrinio darbo tikslas buvo nustatyti erkinio encefalito viruso (EEV) paplitimą šunų kraujo mėginiuose bei nuo šunų nurinktose, kraujo prisisiurbusiose erkėse. Tyrime naudoti šunų kraujo ir erkių mėginiai, tiriami atvirkštinės transkriptazės PGR (AT-PGR) metodu. Buvo išanalizuoti kraujo mėginiai iš trijų šunų grupių: sergančių babezioze, turinčių neurologinių simptomų bei nepatikslintos galutinės diagnozės. Taip pat atlikta temperatūros, C-reaktyvinio baltymo (CRB) bei limfocitų kiekio analizė. Nustatyta, kad EEV paplitimas šunų kraujo mėginiuose siekė 2,3 %, o tarp babezioze sergančių šunų – 6,7 %. EEV nustatytas 18,2 % nuo šunų nurinktų erkių, palyginimui – tarp laisvai ropinėjusių erkių paplitimas siekė 15,6 %. Statistiškai reikšmingai aukštesnė CRB koncentracija (>90 mg/l) nustatyta babezioze sergančių šunų grupėje, o EEV infekuotų šunų CRB reikšmės svyravo nuo 71,6 iki 103,7 mg/l. Be to, EEV paplitimas buvo įvertintas atsižvelgiant į šunų gyvenamąją aplinką: mieste, užmiestyje ir privačiose teritorijose. Aukščiausias EEV paplitimas nustatytas miesto teritorijoje – 20 %. Tyrimo rezultatai atskleidžia EEV riziką šunims ir pabrėžia poreikį išsamiau tirti šios zoonozės epidemiologiją bei galimą riziką žmonių sveikatai.

Lietuvoje piroplazmozės sukėlėjų – Theileria equi ir Babesia caballi – paplitimas, serologinė ar molekulinė diagnostika anksčiau nebuvo tyrinėta ir publikuota, tačiau šiuo tyrimu pirmą kartą buvo įrodytas piroplazmozės paplitimas Lietuvos arklių tarpe. Iš dvylikos Lietuvos savivaldybių buvo surinkti 152 kraujo serumo mėginiai ir 83 kraujo mėginiai. Į tyrimą buvo įtraukti kliniškai sveiki, įvairaus amžiaus, lyties ir veislės arkliai. Tyrimams buvo taikomi du diagnostikos metodai: konkurencinė imunofermentinė analizė (cELISA) antikūnams nustatyti ir polimerazės grandininė reakcija (PGR) tiesiogiai identifikuoti piroplazmų DNR. Piroplazmoms specifinių IgG antikūnų rasta 7,89 ± 4,4 proc. tirtų kraujo serumo mėginių, o piroplazmoms specifinė DNR, 18S rRNR geną koduojančioje srityje, nustatyta 27,7 ± 9,5 proc. tirtų kraujo mėginių. Serologiškai Theileria equi ir Babesia caballi specifiniai antikūnai nustatyti keturiose iš dvylikos tirtų Lietuvos savivaldybių, o molekuliniai metodai arklių piroplazmozės paplitimą atskleidė šešiose iš septynių tirtų savivaldybių. Didžiausias teigiamų mėginių kiekis, naudojant cELISA metodą, buvo užfiksuotas Palangos rajone (46,2 proc.). O taikant PGR metodą, užsikrėtimo dažnis Trakų rajone siekė net 60,0 proc. Analizuojant rizikos veiksnius, kurie gali turėti įtakos užsikrėtimui arklių piroplazmoze, bei vertinant PGR rezultatus, buvo nustatytas statistiškai patikimas ryšys tarp infekcijos dažnio ir arklio veislės (p<0,05). Taip pat buvo nustatytas statistiškai reikšmingas ryšys tarp vietovės, kurioje buvo laikomas arklys ir piroplazmozės paplitimo. Šio papildomo kintamojo svarbą patvirtino tiek cELISA, tiek ir PGR tyrimų rezultatai (p<0,05). Šio tyrimo metu Lietuvoje pirmą kartą serologiškai ir molekuliniais metodais užfiksuotas Theileria equi ir Babesia caballi paplitimas Lietuvos arklių populiacijoje. Atsižvelgiant į klimato kaitą ir erkių kiekio padidėjimą, prognozuojama, kad šių patogenų paplitimas gali dar labiau išaugti, todėl neabejotinai būtų tikslinga atlikti išsamesnius piroplazmų tyrimus visuose Lietuvos žirgynuose ir ištirti sportui, bei rekreacijai naudojamus žirgus.

Darbo tikslas buvo įvertinti Babesia canis paplitimą erkėse bei babeziozės infekcijos ypatumus tarp šunų tiriant PGR pacientų kraujo mėginius, erkes bei atlikus retrospektyvią šunų ligos istorijų analizę atsižvelgiant į pastarąjį dešimtmetį Lietuvoje padidėjusį šunų sergamumą babezioze. Tyrimo metu baltos spalvos medžiaga iš natūralių erkių buveinių surinktos Ixodes ricinus ir Dermacentor reticulatus erkės bei tų pačių rūšių erkės nurinktos nuo šunų kūno paviršiaus ir ištirtos pasitelkiant PGR. Atliekant PGR ir kraujo tepinėlio mikroskopinį tyrimą ištirti sergančių ar įtariamų sergant šunų kraujo mėginiai. Šunys tyrimui atrinkti pagal anmanezės, klinikinio ir kraujo tyrimų duomenis. Surinktuose mėginiuose ieškota B. canis DNR. Taip pat atlikta šunų, kuriems buvo nustatyta babeziozė, retrospektyvi ligos istorijų analizė. Atlikus tyrimą nustatyta, jog didžiausias erkių paplitimas yra pievoje (p<0,05), tiek D. reticulatus (p<0,05), tiek I. ricinus (p<0,01) daugiausia aptikta pievoje, daugiausia surinkta kovo mėnesį (p<0,05), spalio mėnesį D. reticulatus nepasitaikė (p<0,001), o I. ricinus surinkta mažiausiai (p<0,001). Nuo šunų daugiausia erkių surinkta kovo mėnesį (p<0,001). Didžiausias kiekis D. reticulatus ant šunų buvo kovo mėnesį (p<0,001), I. ricinus – birželį (p<0,001), o kraujo prisisiurbusių erkių – gegužę (p<0,001). PGR rezultatai pagal erkių rūšis nesiskyrė (p=0,08). Kraujo mikroskopijos rezultatai nepriklausė nuo PGR rezultatų ir atvirkščiai (p=0,4). Nuo tiriamojo gyvūno lyties nepriklausė nei mikroskopijos (p=0,2), nei PGR (p=0,5) rezultatai, nuo veislės nepriklausė nei mikroskopijos (p=0,8), nei PGR (p=0,9) rezultatai.

Tick-borne encephalitis (TBE) is one of Europe and Asia’s most important tick-borne zoonoses. In Lithuania, the incidence of EE in people has been one of the highest in Europe for more than a decade. TBE is a naturally occurring focal infection, and the prevalence of tick-borne encephalitis virus (TBEV) is thought to depend on the interaction between ticks and their hosts and environmental and climatic conditions. The detection of TBEV and its specific antibodies in viral hosts is important for detecting and monitoring virus foci. The prevalence of TBEV among small wild rodents (reservoir hosts) and dogs (accidental hosts) has not been studied in detail in Lithuania before. Only a few studies have been conducted in other endemic countries. The dissertation presents the results of the prevalence of TBEV among small wild rodents caught in virus foci, obtained using standard molecular methods and the method of virus propagation in mouse neuroblastoma Neuro-2a cell cultures. The dissertation also presents the prevalence of TBEV and its specific antibodies and possible risk factors for the fatal outcome of TBE disease among randomly selected dogs that visited veterinary clinics. The successful detection of TBEV RNA by molecular methods revealed that this method is useful for early diagnosis of TBE. The obtained data are relevant on a global scale, providing more missing information about the incidence of TBE in dogs, the clinical course of the disease, and risk factors.

Dažnu atveju laisvai ropojančiose erkėse erkinio encefalito virusas (EEV), kuris yra zoonotinis patogenas, tiesioginiais molekuliniais tyrimo metodais nenustatomas arba titras ir erkių užkrėstumas labai mažas. Tačiau mokslininkų nustatyta, jog pasimaitinusioje – prisisiurbusioje kraujo erkėje – viruso koncentracija padidėja kelis šimtus kartų. Tai pirmas tokio pobūdžio kryptingai atliktas žvalgomasis tyrimas Lietuvoje, kurio metu erkinio encefalito viruso atžvilgiu tirtos nuo šunų surinktos, laisvai ropojančios erkės (n=160) ir šunų kraujo prisisiurbusios erkės (n=90). Pagrindinis šio darbo tikslas buvo išsiaiškinti šių tiriamųjų erkių grupių užkrėstumą erkinio encefalito virusu ir įvertinti EEV gyvybingumą bei replikacijos galimybes pelių neuroblastomos persėjamoje ląstelių kultūroje (Neuro–2a). Tyrimo metu virusinės RNR nustatymui naudota lizdinė AT-PGR, o rezultatai vertinti elektroforezės gelyje. Laisvai ropojančių erkių suspensijose nustatytas bendras minimalus užkrėtimo dažnis (MIR) 8,75 proc. (95 proc. PI 4,37–13,13), o šunų kraujo prisisiurbusių erkių – 37,78 proc. (95 proc. PI 27,76–47,79). Patvirtinta, jog erkinio encefalito virusas gali būti sėkmingai izoliuotas Neuro–2a ląstelių kultūroje, nesukeldamas citopatinio efekto. Po dviejų mėginių kultivavimo etapų ląstelių kultūroje teigiamų erkinio encefalito viruso atžvilgiu mėginių kiekis reikšmingai padidėjo tik kraujo prisisiurbusių erkių tiriamoje grupėje (p<0,001). Laisvai ropojančių erkių tiriamoje grupėje teigiamų mėginių EEV atžvilgiu kiekis tendencingai mažėjo ir po trečiojo kultivavimo MIR nustatytas 2,5 proc. (p<0,001). Iš dalies, šunų kraujo prisisiurbusių, erkių mėginių, kurie pirminėse suspensijose buvo nustatyti neigiami EEV atžvilgiu, jau po pirmojo kultivavimo 30/56 (53,57 proc.) (p>0,05), o po antrojo net 40/56 (71,43 proc.) mėginių nustatyti teigiami EEV atžvilgiu (p<0,001).

Šiame darbe aprašyti pirmieji išsamūs erkinio encefalito viruso paplitimo naminių ožkų ir avių piene rezultatai. Gauti duomenys atskleidė stebėtinai aukštą viruso paplitimo mastą bei davė daug mokslui naujų žinių apie rizikos veiksnius, susijusius su pieno ir pieno produktų sauga. Duomenys taip pat paskatino sukurti naują, patikimą, neinvazinį ir paprastai naudojamą metodą, skirtą viruso cirkuliavimo gamtoje stebėsenai, kuris, tikimasi, gali pasitarnauti kaip nacionalinė erkinio encefalito stebėsenos strategija arba gali būti pritaikytas endeminėms vietovėms stebėti kitose šalyse. Šiame darbe aprašyti rezultatai taip pat apima išsamią erkinio encefalito virusui specifinių antikūnų paplitimo arkliuose analizę. Kartu yra aprašyti ir pirmieji sėkmingo erkinio encefalito viruso aptikimo arklių organizme bei sekoskaitos rezultatai.

Hepatito E virusas (HEV) - plačiai Europos žmonių ir gyvūnų populiacijose paplitęs patogenas, paprastai siejamas su besimptome infekcijos išraiška. Tačiau rizikos grupei priklausančių (pvz. imunosupresinės būklės) pacientų tarpe virusas neretai tampa pražiūrima su įvairiomis organų sistemomis susijusių pažeidimų priežastimi. Nepaisant daug dėmesio, skiriamo sukėlėjo tyrimams Vakarų Europoje, informacijos apie HEV paplitimą Lietuvoje ir čia vyraujančias padermes vis dar trūksta. Disertacijoje pristatomi duomenys iš pirmųjų HEV paplitimo Lietuvoje tyrimų, įvertinančių epidemiologinę situaciją rizikos grupėms priklausančių žmonių bei gyvūnų populiacijose. Detalesnis Lietuvoje paplitusių HEV padermių molekulinis charakterizavimas atliktas filogenetinės analizės pagalba, įvertinant genetinius panašumus tarp lietuviškų ir kitose Europos valstybėse paplitusių, bei tarp žmonių ir gyvūnų populiacijose vyraujančių viruso padermių. Disertacijoje taip pat pristatomi tyrimų, skirtų įvertinti Lietuvoje izoliuotų HEV padermių savybes užkrėsti įvairių audinių kilmės ląsteles, priklausančias skirtingoms gyvūnų rūšims, rezultatai. Pastarieji, kartu su viruso kapsidės baltymo poveikio eksperimentinių kiaulių imuninės sistemos ląstelėms tyrimo duomenimis, atskleidė daug naudingos informacijos apie Lietuvoje paplitusių HEV padermių zoonotines savybes, replikacijos ciklą skirtingų audinių ląstelėse, bei viruso kapsidės baltymo pritaikomumą vakcinos kūrimui.

Erkinio encefalito virusas (EEV) yra ypač auganti grėsmė, nes susirgimų erkiniu encefalitu daugėja ir šis virusas geografiškai greitai plinta. Didelis pavojus užsikrėsti EE žmonėms yra vartojant užkrėstą nepasterizuotą ožkų pieną ir jo produktus. EE liga sukelia neurologinius sutrikimus, kurie gali išlikti visą likusį žmogaus gyvenimą. Svarbu paminėti tai, jog šis virusas yra zoonotinis, tačiau klinikiniai požymiai gali pasireikšti tik kai kurioms gyvūnų rūšims. Ši sritis Lietuvoje dar nebuvo tyrinėta, todėl buvo labai svarbu atlikti žvalgomuosius EEV paplitimo tyrimus ožkų piene. Šio darbo tikslas – molekuliniais metodais įvertinti žmonėms pavojingo erkinio encefalito viruso žvalgomąją epidemiologinę situaciją Lietuvoje laikomų ožkų piene. Iš viso buvo surinkti ir molekuliniais tyrimais ištirti 283 ožkų pieno mėginiai. Šio tyrimo objektai - 8 privatūs ožkų ūkiai, kurie pasiskirstę po visą Lietuvą. Mėginiai rinkti nuo birželio iki spalio mėnesio, ganykliniu laikotarpiu, laktacijos periodu. Tyrimams naudoti bendri jungtiniai (iš bendros pieno talpos) ožkų pieno mėginiai, kurie buvo imti periodiškai kas keturias dienas iš kiekvieno ūkio. Taikant konvensinės ir realaus laiko TaqMan polimerazinės grandininės reakcijos metodus bei skirtingus oligonukleotidinius pradmenis (NS3, NS5, NCR5) ištirti ožkų pieno mėginiai bei gauti preliminarūs rezultatai. Teigiamų RNR viruso mėginių nustatyta 15 (5,3 proc. [CI% 3,00-8,59]), rezultatai gauti panaudojus NS5, NCR5 oligonukleotidinius pradmenis. Atlikus tyrimus su NS3 oligonukleodiniais pradmenimis įvertinta, kad diagnostikoje šie pradmenys netinka (p<0,001). Ištyrus jungtinius ožkų pieno mėginius nustatyta koreliacija tarp teigiamų mėginių skaičiaus ir ūkio dydžio. Mažesniuose ūkiuose statistiškai nustatyta daugiau teigiamų erkinio encefalito viruso mėginių, nei dideliuose ūkiuose (p<0,05). Įvertinus teigiamų mėginių pasiskirstymą tarp skirtingų Lietuvos rajonų ir skirtingų laktacijos mėnesių, statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta.

Atliekant CRB koncentracijos tyrimus sveikų ir sergančių šunų kraujo serumo mėginiuose buvo siekiama išsiaiškinti, kaip susiję klinikinėje praktikoje dažniausiai pasitaikančios patologijos su C reaktyvaus baltymo kiekio pokyčiais ligos pradžioje ir po gydymo procedūrų. Tyrimo metu CRB koncentracija šunų kraujo serume buvo nustatoma naudojantis analizatoriaus Eurolyzer pagalba. Tyrimo metu buvo paimta ir ištirta 286 sergančių šunų ir 22 sveikų šunų kraujo rodikliai. Sergančių šunų C reaktyvaus baltymo tyrimo rezultatai buvo gauti įvertinus dažniausiai klinikinėje praktikoje pasitaikančias patologijas: piometrą, babeziozę, įvairias traumas, pneumoniją, parvovirusinį enteritą, ūminį pankreatitą. CRB koncentracija esant šioms patologijoms buvo vertinama ligos pradžioje ir baigiant gydymo procedūras. Tiriamųjų sveikų šunų CRB koncentracija kraujo serume buvo mažesnės nei 10 (mg/l) ir jos lygiui neturėjo įtakos šunų veislė, amžius, lytis, tačiau tiriant rujojančias kales CRB koncentracija padidėja nuo iki 15,77 (mg/l), o šuningų kalių serume šis rodiklis gali siekti ir 42,1 ( mg/l). Tiriamųjų sergančių šunų C reaktyvaus baltymo pokyčiai kraujo serume svyravo nuo 60,2 (mg./l) iki >270,0 (mg/l). Didžiausias C- reaktyviojo baltymo koncentracijos padidėjimas buvo nustatytas šunims, kuriems buvo diagnozuota piometra (236,3 mg/l -272,8 mg/l-), babeziozė (212,4 mg/l-268,1 (mg/l-), ūmus pankreatitu (190,6 mg/l - >270 mg/l), įvairios traumos (190,7 mg/l- 260,0 mg/l- mg/l), pneumonija (189,9 mg/l -235,3 mg/l), opinis gastritas (179,4 mg/l- 231,5 mg/l). Iš visų tirtų ligų mažiausiai CRB koncentracija kilo sergant cistitu (60,2 mg/l- 94,7 mg/l). esant palankiai gydymo eigai visų ligų atvejais CRB į normos ribas grįžo 5-7 dieną pradėjus gydymą, išsivysčius ligų komplikacijoms- 10 gydymo dieną. Kadangi daugelio patologijų atveju padidėja šunų kūno temperatūra ir tuo pačiu CRB koncentracija, šio tyrimo metu buvo bandoma įvertinti abiejų klinikinių parametrų sąsajas. Apibendrinti rezultatai parodė, kad padidėjusios temperatūros vidurkis ir C-reaktyvinio baltymo rodiklių vidurkis turėjo silpną koreliaciją (r=0,238).