Steponaitienė, Rūta

Baigiamojo magistro darbo autorius: Inesa Kirilevičiūtė Baigiamojo magistro darbo vadovas: dr. Rūta Steponaitienė Baigiamojo magistro darbo konsultantas: j.m.d. Rūta Inčiūraitė Baigiamojo magistro darbo pavadinimas: ,,Žarnyno komensalinių bakterijų sąveikos su sergančiųjų opiniu kolitu ir sveikų individų epitelinėmis ląstelėmis vertinimas“

Darbo tikslas: nustatyti opinio kolito pacientų bei sveikų individų storosios žarnos epitelinių ląstelių atsaką mikroRNR lygmenyje į stimuliaciją Escherichia coli bei Phocaeicola vulgatus bakterijomis.

Darbo uždaviniai:

1. Charakterizuoti storosios žarnos epitelinių organoidų monosluoksnių sekretuojamų ekstraląstelinių pūslelių dydį, morfologines savybes ir baltyminius žymenis.
2. Įvertinti su opiniu kolitu siejamų mikroRNR raiškos pokyčius storosios žarnos epitelinių organoidų monosluoksniuose po sąveikos su Phocaeicola vulgatus ir Escherichia coli opinio kolito ir sveikų individų kontrolinėje grupėse.
3. Įvertinti su opiniu kolitu siejamų mikroRNR raiškos pokyčius storosios žarnos epitelinių organoidų monosluoksnių po sąveikos su Phocaeicola vulgatus ir Escherichia coli sekretuojamose ekstraląstelinėse pūslelėse opinio kolito ir sveikų individų kontrolinėje grupėse.

Tyrimo objektas ir metodai: Tiriamųjų imtis sudaryta iš LSMU Virškinimo sistemos tyrimų instituto sukauptos žmogaus žarnyno organoidų kolekcijos, kurią sudarė (i) opinio kolito pacientų (n=10) ir (ii) kontrolinės grupės individų (n=10) mėginiai. Tiriamųjų amžiaus ir lyčių pasiskirstymas abiejose grupėse reikšmingai nesiskyrė. Baigiamojo darbo tyrimo metu buvo vykdomas storosios žarnos epitelinių monosluoksnių formavimas iš organoidų kultūrų, jų kultivavimas su bakterijomis, RNR išskyrimas iš ląstelių ir ekstraląstelinių pūslelių, taikininė miRNR raiškos analizė atvirkštinės transkripcijos – kiekybinės tikrojo laiko PGR metodu ir ląstelių ekstraląstelinių pūslelių izoliavimas bei jų charakterizavimas, pasitelkiant ELISA, Cryo-TEM bei dinaminės šviesos sklaidos metodus.

Rezultatai: Atliktas tyrimas parodė, kad dauguma storosios žarnos epitelinių monosluoksnių kultūrų terpėse aptiktų ekstraląstelinių pūslelių buvo būdingo egzosomoms dydžio (~50–150 nm) ir ekspresavo specifinius žymenis (CD63 ir HSP70). MikroRNR raiškos analizei pirmiausia buvo įvykdyta išsami miRNR atranka, identifikuota 10 mikroRNR, kurių raiška storosios žarnos kriptų viršutinės dalies ląstelėse aktyvaus opinio kolito metu, palyginti su kontrole, buvo padidėjusi (log2PK > 1,5, FDR < 0,05). Identifikavus teorinius šių miRNR genus taikinius komensalinių bakterijų – Phocaeicola vulgatus ir Escherichia coli – genomuose, funkcinei analizei buvo pasirinktos šios mikroRNR: miR-135b-5p, miR-146a-5p ir miR-183-5p. Su opiniu kolitu siejamų ląstelių bei jų ekstraląstelinių pūslelių taikininė miRNR raiškos analizė kontrolės ir opinio kolito grupėse po stimuliacijos storosios žarnos epitelinių ląstelių su Phocaeicola vulgatus ir Escherichia coli bakterijomis atskleidė šių komensalinių bakterijų veiksmingumo potencialą, tačiau nustatyti skirtumai neparodė statistinio reikšmingumo lygmens. Nepaisant to, fiksuotos tendencijos atskleidė skirtingą Escherichia coli ir Phocaeicola vulgatus bakterijų įtaką kontrolinės ir opinio kolito grupės storosios žarnos epitelinių ląstelių mikroRNR raiškai bei jų išskyrimui ekstraląstelinėse pūslelėse, tačiau stipresnį poveikį miRNR raiškai parodė Escherichia coli bakterija abiejose tiriamosiose grupėse.

Išvados:

1. Iš nestimuliuotų ir Escherichia coli bei Phocaeicola vulgatus bakterijomis stimuliuotų storosios žarnos epitelinių organoidų monosluoksnių kultūrų terpių izoliuotos ekstraląstelines pūslelės buvo egzosomoms būdingo dydžio (~50–150 nm), pasižymėjo egzosomoms būdingomis morfologinėmis savybėmis ir ekspresavo specifinius baltyminius žymenis - CD63 ir HSP70.
2. Storosios žarnos epitelinių organoidų monosluoksniuose po sąveikos su komensalinėmis bakterijomis opinio kolito ir sveikų individų kontrolinėje grupėse nustatyti mikroRNR raiškos pokyčiai nepasiekė statistinio reikšmingumo lygmens. Stimuliacija Escherichia coli pademonstravo tendenciją didinti mikroRNR-135b-5p, mikroRNR-183-5p ir mikroRNR-146a-5p raišką opiniu kolitu sergančiųjų grupėje, o sveikų individų kontrolinėje grupėje – didinti mikroRNR-146a-5p ir mažinti mikroRNR-135b-5p bei mikroRNR-183-5p raišką. Phocaeicola vulgatus sukėlė nežymų, tačiau specifinį mikroRNR-146a-5p raiškos padidėjimą tik kontrolinėje grupėje.
3. Storosios žarnos epitelinių ląstelių ekstraląstelinėse pūslelėse po sąveikos su komensalinėmis bakterijomis opinio kolito ir sveikų individų kontrolinėje grupėse nustatyti mikroRNR raiškos pokyčiai nepasiekė statistinio reikšmingumo lygmens. Sąveika su Escherichia coli sąlygojo mikroRNR-146a-5p, mikroRNR-135b-5p ir mikroRNR-183-5p raiškos didėjimą opiniu kolitu sergančiųjų pacientų grupėje, o sveikų asmenų kontrolinėje grupėje – mikroRNR-146a-5p raiškos didėjimą ir mikroRNR-183-5p bei mikroRNR-135b-5p mažėjimą. Phocaeicola vulgatus opiniu kolitu sergančiųjų grupėje mažino mikroRNR-135b-5p ir mikroRNR-183-5p, o kontrolinėje grupėje – visų trijų tirtų miRNR raišką.

Bakalauro baigiamojo darbo autorius: Kirilevičiūtė I. Tema: Žarnyno organoido epigenetinio stabilumo vertinimas Mokslinis vadovas: dr. Rūta Steponaitienė Atlikimo vieta: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Virškinimo sistemos tyrimų institutas, Klinikinės ir molekulinės gastroenterologijos laboratorija Santraukos turinys: Opinis kolitas (OpK) yra lėtinė, progresuojanti imuninės kilmės uždegiminė žarnyno liga. Šios ligos etiopatogenezei yra labai svarbūs genetiniai, epigenetiniai, mikrobiologiniai bei aplinkos veiksniai. Siekiant geriau suprasti šią ligą sąlygojančius veiksnius ir procesus yra kuriamos 3D organoidų modelinės sistemos. Šio darbo tikslas buvo įvertinti organoidų, sugeneruotų iš sergančių opiniu kolitu ir sveikų asmenų storosios žarnos kamieninių ląstelių, epigenetinį stabilumą. Iškeltiems uždaviniams įvykdyti buvo kultivuojamos bei charakterizuojamos organoidų kultūros, išskiriama DNR iš kriptų mėginių, biopsijų bei organoidų kultūrų. Atliktas DNR kiekio ir kokybės įvertinimas, išskirtos DNR bisulfitinė modifikacija. Buvo vykdomas bisulfitu modifikuotos DNR pagausinimas PGR, naudojant biotinu žymėtus LINE-1 pradmenis, taip pat gautų PGR produktų dydžio ir kokybės įvertinimas agarozės gelyje. Atliktas biotinu žymėtų PGR produktų sugaudymas streptavidino sefarozės dalelėmis, pagausintų mėginių paruošimas pirosekoskaitai bei LINE-1 CpG salų metilinimo kiekybinis nustatymas. Gauti rezultatai parodė, kad išauginti organoidai pasižymėjo epitelio poliškumu, formavo glaudžiąsias jungtis, buvo aptiktos proliferuojančios ląstelės ir nedidelė dalis specializuotų žarnyno ląstelių, t. y. kolonocitų, gobleto ląstelių, enteroendokrininių ląstelių. Atlikta statistinė analizė, remiantis Mann-Whitney U-testo statistiniu palyginimu, parodė, kad kontrolinėje grupėje tirtojo LINE-1 regiono CpG salų metilinimo lygis išlieka nepakitęs, t. y. skirtumai yra statistiškai nepatikimi (p > 0,05 visoje modelinėje sistemoje). Opinio kolito remisijos grupėje nustatyti keli statistiškai reikšmingi skirtumai tarp biologinės medžiagos mėginių: biopsija vs. organoidai P0 p = 0,013, biopsija vs. organoidai P1 p = 0,0024, biopsija vs. organoidai P5 p = 0,016, ir kriptos vs. organoidai P1 p = 0,018. Aktyvaus opinio kolito grupėje statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas tik lyginant biopsiją vs. organoidus P1 (p = 0,023). Gauti rezultatai leido daryti išvadas, kad kontrolinė storosios žarnos 3D organoido modelinė sistema lyginant su pirminiu jos šaltiniu (t. y. biopsijos mėginiu), pasižymi stabiliu DNR metilinimo lygiu, o opinio kolito grupėse stebimi statistiškai reikšmingi skirtumai. Palyginus LINE-1 metilinimo lygį tarp skirtingų organoidų persėjimų, nustatyta, jog statistiškai patikimų skirtumų nei vienoje grupėje nėra, todėl organoidų kultūra išlieka epigenetiškai stabili viso ilgalaikio kultivavimo metu. Taip pat statistinė analizė atskleidė, kad atlikto tyrimo tiriamųjų imtyje LINE-1 metilinimo lygis nėra ligai specifinis ir jis statistiškai nesiskiria lyginant kontrolinę ir sergančiųjų grupes visuose biologinės medžiagos taškuose, išskyrus storosios žarnos organoidų kultūrą po pirmo persėjimo (P1).