Rodovičius, Hiliaras

Darbo tikslas: atlikti kokybinę antrinių metabolitų analizę žaliojoje, ulongo ir juodojoje arbatose ir kiekybiškai įvertinti epigalokatechino galatą ir rutiną efektyviosios skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu. Darbo uždaviniai:

1. Pritaikyti antrinių metabolitų išskyrimo sąlygas iš žaliosios, ulongo ir juodosios arbatinių augalinių žaliavų.
2. Atlikti kokybinę antrinių metabolitų analizę žalioje, ulongo ir juodoje arbatinėje žaliavoje taikant efektyviosios skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos (ESC – MS) metodą.
3. Įvertinti antrinių metabolitų pasiskirstymą tarp skirtingos fermentacijos arbatos rūšių.
4. Atlikti kiekybinę epigalokatechino galato ir rutino analizę taikant efektyviosios skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos (ESC – MS) metodą. Rezultatai ir išvados: Nustatyta, kad antrinių metabolitų išskyrimui efektyviausias ekstrahentas yra vandeninis metanolio tirpalas (santykiu 1:3). Šio tirpiklio ekstrakte nustatyta daugiausiai junginių: 980 žaliojoje, 864 ulongo bei 890 juodojoje arbatose. Atlikus skirtingų fermentacijų arbatų kokybinę antrinių metabolitų analizę, žaliojoje arbatoje buvo identifikuoti 33, ulongo arbatoje 23, o juodosios arbatos ekstrakte 18 antrinių metabolitų. Identifikuoti junginiai yra priskiriami polifenolų bei alkaloidų grupėms. Lyginant antrinius metabolitus tarp skirtingų fermentacijų arbatų rūšių, nustatyta, kad žaliojoje ir ulongo arbatoje yra 15, žaliojoje ir juodojoje arbatoje – 8, o ulongo ir juodojoje – 6 bendri identifikuoti antriniai metabolitai. Atlikus epigalokatechino galato ir rutino kiekybinio įvertinimo metodo validaciją, nustatyta, kad didžiausia epigalokatechino galato koncentracija yra žaliosios arbatos vandeniniame metanolio ekstrakte – 294,91 ± 0,243 μg/ml, o mažiausia – juodosios arbatos vandeniniame aceotonitrilo ekstrakte – 16,49 ± 0,13 μg/ml. Didžiausia rutino koncentracija nustatyta žaliosios arbatos vandeniniame metanolio ekstrakte – 49,58 ± 0,19 μg/ml, o mažiausia – juodosios arbatos vandeniniame etanolio ekstrakte – 25,26 ± 0,27 μg/ml.

Sukelti S. aureus (04-02981) padermėms metabolinį stresą veikiant antibiotikais – trimetoprimu ir norsulfazoliu. Nustatyti bakterijų augimą stabdančius medžiagų apykaitos procesus S. aureus (04-029811) padermėse po paveikimo su antibiotikais (trimetoprimu ir norsulfazoliu). Identifikuoti paveiktą antibiotikais metabolinį S. aureus profilį naudojant tandeminę skysčių chromatografiją su masių spektrometrija.

Pavadinimas: Vortioksetino kokybinis ir kiekybinis įvertinimas biologiniuose skysčiuose efektyviosios skysčių chromatografijos–masių spektrometrijos (ESC–MS) metodu. Magistranto Kęstučio Jurgaičio magistro baigiamasis darbas, mokslinis vadovas prof. dr. H. Rodovičius; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra. – Kaunas, 2018.

Darbo tikslas: Kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti vortioksetiną biologiniuose skysčiuose efektyviosios skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu.

Darbo uždaviniai:

1. Išvystyti ir validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos (ESC – MS) metodiką vortioksetino analizei biologiniuose skysčiuose.
2. Išskirti vortioksetiną iš biologinių skysčių (kraujo serumo, šlapimo ir seilių) kietafazės mikroeliucinės ekstrakcijos metodu.
3. Įvertinti vortioksetino koncentraciją kraujo serume skirtingais laiko momentais po išgertos vienkartinės vaisto dozės.

Metodai: Kraujo, šlapimo ir seilių mėginių analizė atlikta panaudojus tandeminį Agilent Technologies 1260B skystinį chromatografą sujungtą su 6530B Accurate–Mass Q–TOF masių spektrometriniu detektoriumi. Analičių išskirstymui panaudotos atvirkštinių fazių core–shell technologijos chromatografinės kolonėlės: Poroshell 120 EC–C18 3 x 50 mm, 2,7 µm (Agilent InfinityLab 699975–302) ir Kinetex 1,7 µm C18 100Å 2,1 x 30 mm (Phenomenex 00A–4475–AN) su SecurityGuard ULTRA, UHPLC C18 sub–2 µm 2,1 mm ID (Phenomenex AJ0–8782) prieškolonėle. Mobiliai fazei panaudoti šie tirpikliai: A: 10 mM amonio formiato vandenyje ir B: 10 mM amonio formiato acetonitrile. Atlikta gradientinė eliucija (Poroshell: 0–1 min–A:95%, B:5%; 1–10 min–A:0%, B:100%; 10–15 min–A:0%, B:100%. Kinetex: 0–0,25 min–A:95%, B:5%; 0,25–5 min–A:0%, B:100%; 5–5,5 min–A:0%, B:100%; 5,5–6 min–A:95%, B:5%), tėkmės greitis: Poroshell kolonėlei 1,25 ml/min, o Kinetex – 0,725 ml/min. Serumo mėginiai paruošti naudojant kietafazę mikroeliucinę ekstrakciją (panaudojant 96 šulinėlių Strata™–X–C (Phenomenex 8M–S029–4GA) polimerinę stiprių katijonų plokštelę). Analizės atliktos teigiamos MS ir MS/MS jonizacijos rėžime.

Rezultatai: Išvystytos metodikos tiesiškumas nustatytas 0,02–50 ng/ml diapazone (Regresijos lygtis: y=2,00104x+2,71103; R2=0,9999). Analitės aptikimo riba–0,003 ng/ml, nustatymo riba–0,010 ng/ml. Metodika validuota pagal specifiškumą (Rs≥2,7; PI≥0,9994), selektyvumą (6 „tušti mėginiai“), tiesiškumą (6 kalibracinės kreivės taškai ir 4 kokybės kontrolės mėginiai), tikslumą (100,98±3,75; 80,1–118,8%) ir glaudumą (100,14±3,64; 2,53 %RSD – pakartojamumas ir 103,3±3,44; 3,10 %RSD – atkartojamumas). Metodika panaudota nustatant vortioksetino koncentracijos kitimą kraujo serume laiko atžvilgiu (Cmax=7,46; Tmax=12,12).

Išvados:

1. Išvystyta ir validuota ESC–MS metodika, leidžianti identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti vortioksetiną kraujo serume.
2. Seilių ir šlapimo mėginiuose vortioksetinas nustatytas tik kokybiškai, dėl per mažos koncentracijos, kuri negali būti patikimai kiekybiškai įvertinta.
3. Sudaryta kalibracinė kreivė yra koncentracijų riboje nuo 0,02 iki 50 ng/ml. Pagal tyrimų duomenis vortioksetino koncentracija biologiniuose mėginiuose svyruoja nuo 0,07 ng/ml iki 7,46 ng/ml, todėl kalibracinė kreivė pilnai tinkama vortioksetino koncentracijų įvertinimui.
4. Pagal išvystytą ESC–MS metodiką nustatytas vortioksetino koncentracijos kitimas laiko atžvilgiu: Cmax=7,46 ng/ml; Tmax = 12,12 val; AUC = 265,7 ng*val/ml; T½=23,5 val.
5. Išvystyta metodika yra paprasta, greita, tiksli ir tinkama farmakokinetinei bei terapinei vaistų stebėsenai.

Darbo tikslas – sintezuoti tetrazolo struktūrinį fragmentą, remiantis in silico parametrais. Rezultatai - apskaičiuoti struktūrinių fragmentų parametrai in silico, jie analizuoti bei sudaryta biblioteka, iš kurios pasirinktas junginys sintezei. Pirmos pakopos sintezės metu gautas junginys 5-aminotetrazolas, vėliau antrosios pakopos metu iš šio produkto sintezuotas 5-vinilsulfonamido tetrazolas. Sintezuoto junginio grynumas - 95 %.

Tyrimo tikslas: susintetinti 1,3,4-tiadiazolo darinius, optimizuoti reakcijų sąlygas, įvesti fluoro atomą pritaikant Balz-Shieman reakciją. Tyrimo išvados:

1. Susintetinti keturi 1,3,4-tiadiazolo dariniai, panaudojant skirtingas Eva Akerblom ir Kurt Skagius, Rao ir Srinivasan, Pedro Ortega-Luoni, ir C. Ainsvort metodikas.
2. Atliktas reakcijų optimizavimas, reakcija vyko greičiau ir išeiga buvo didesnė, kai oksidatorius yra bevandenis geležies (III) chloridas, o ekstrahentas etilacetatas.
3. Junginių struktūros patvirtintos FT – IR ir MS spektrinės analizės metodais, o priemaišų analizė – ESC–MS metodu. Gautų junginių grynumas: 80-96%.
4. Balz-shieman reakcija klasikiniu būdu su 1,3,4-tiadiazolais nevyksta. Modifikavus sąlygas, palaikant žemą pH reikšmę, temperatūrą ir naudojant perteklių tetrafluorborato rūgšties, bei natrio nitrito, reakcija įvykdyta.

Dvipakopės sintezės metodu gauti keturi galutiniai junginiai – 3,5-difenilizoksazolo dariniai, kurių išeigos 29-64%. Vienpakopės sintezės metodu gauti taip pat keturi 3,5-difenilizoksazolo dariniai, kurių išeigos 7-54%. Taip pat atlikus sintezę be tarpinių junginių gryninimo, galutinis izoksazolas buvo užterštas šalutiniais reakcijos produktais. Sintezės metu susidaro identišką masę turintys, kaip manoma, 3,5-difenilizoksazolų struktūriniai regioizomerai.

Tyrimo tikslаs – Vertinti prieštuberkuliozinių junginių, esančių ikikliniuose ir klinikiniuose tyrimuose struktūros aktyvumo ryšį, įvertinti molekulinius parametrus in silico. Tyrimo uždаviniаi: 1.Apžvelgti ir išanalizuoti naujausių junginių klases, esančių ikiklinikiniuose ir klinikiniuose tyrimuose tuberkuliozės gydimui.  2.Įvertinti naujausių junginių, esančių ikiklinikiniuose ir klinikiniuose tyrimuose, naudojamų tuberkuliozės gydimui struktūros aktyvumo ryšį. 3.Įvertinti ikiklinikiniuose tyrimuоse esаnčių, prieštuberkuliоziniu аktyvumu pаsižyminčių, junginių molekulinius paremetrus pagal Lipinskio penketo taisyklę. Tyrimо metоdаi.Darydama darbą remiausi šiomis literatūros bazėmis: PubMed/Medline (Didžiausia bibliografinė duomenų bazė, kuri apima 11 mln. bibliografinių įrašų į daugiau nei 4300 biomedicinos žurnalų iš viso pasaulio), Science Direct Sumsearch (Universali visatekstė Elsevier, Academic Press ir kitų mokslo leidyklų žurnalų duomenų bazė), iš šių duombazių surinkau 44 ikiklinikinius, klinikinius ir rinkoje naudojamus TBC junginius, juos perbraižiau su MarvinSketch ir Chemdraw programa, toliau nubraižytus junginius perkeliau į Canvas (Schrodinger programinis paketas) [18]. Tyrimо rezultаtаi. Remiantis atliktais prieštuberkuliozinių junginių, esančių ikiklinikiniuose ir klinikiniuose tyrimuose struktūros ir aktyvumo ryšio analizės rezultatais gauta išvada, jog analizuotų junginių cheminė struktūra vaidina svarbų vaidmenį baktericidiniam aktyvumui. Nustatyta kad iš 18 junginių klasių biologiškai aktyvių junginių daugiausiai narių turi oksazolidinonų (6), florochinolonų (8) ir 5–nitroimidazolų (6) klasių junginiai. Be to, nustatyta, kad oksazolidinonų, florochinolonų bei 5–nitroimidazolų klasėms būdingos griežtos struktūros aktyvumo ryšio taisyklės, apsprendžiančios šių junginių klasių prieštuberkuliozinį aktyvumą. Daugelis tirtų struktūrų atitinko Lipinski‘o penketo taisyklę.

Ryčio Mačionio magistro baigiamasis darbas „4-tiazolidinono junginių sintezė ir jų poveikio S. aureus metaboliniams pokyčiams vertinimas“. Remiantis in silico rezultatais, atrinkti prognozuojamai potencialiausi, 4-tiazolidinono pagrindą turintys,1,4-dihidroksi-2-naftoilo kofermento A sintazės slopikliai. Atlikta 19, 4-tiazolidinono pagrindą turinčių, junginių, su skirtingais pakaitais 3-oje ir 5-oje padėtyse, sintezė. Junginių tapatybė įvertinta UV ir IR metodais. Lydymosi temperatūra nustatyta Koflerio prietaisu, priemaišų analizė – TLC. Junginių grynumas ir S. aureus metabolinių pokyčių tyrimui panaudotas LC-MS Q-TOF. Rezultatai parodė, kad junginiai sukėlė purino, terpenoidų, karotenoidų, glicerolfosfolipidų, nukleotidinių cukrų biosintezėje dalyvaujančių metabolitų pokyčius. Ištyrus menakvinono metabolinį pokytį, nustatyta, kad tik vienas, priešingai in silico tyrimo rezultatams, sintezuotas junginys (G11) pasižymėjo ženkliu aktyvumu. Papildoma duomenų analizė parodė ženklius kitų metabolitų pokyčius. N-substituoti tiazolidinono junginiai lėmė terpenoidų (fitilo difosfato, oktaprenilo difosfato, menakvinono) ir karotenoidų (spiriloksantino, stafiloksantino, 2-ketospiriloksantino, kaloksantino) biosintezėje dalyvaujančių metabolitų sumažėjimą. Tuo tarpu veikiant tiek N-substituotais, tiek 5-substituotais 4-tiazolidinono junginiais, GDP-6-deoksi-D-talozės, diadenozino trifosfato, fruktozės-lizino-6-fosfato pokyčių nepastebėta.

Tyrimo tikslas: nustatyti heterociklų, turinčių S ir N heteroatomų, metabolominį poveikį S. aureus folio rūgšties kaskadai. Tyrimo uždaviniai:

1. Sintetinti penkianarius heterociklus, turinčius S ir N heteroatomus (MR).
2. Nustatyti MR junginių tapatybę, fiziko-chemines savybes.
3. Atlikti sintetintų MR junginių metabolitų pokyčio tyrimą veikiant S. aureus.
4. Atlikti gautų junginių molekulinį modeliavimą in silico Tyrimo metodai: MR junginiai sintezuojami ciklizacijos reakcijos metodu. MR sintetinių junginių struktūra įrodyta ultravioletinės (UV), infraraudonosios (IR) spinduliuotės ir masių spektrometrijos metodais. Grynumas nustatytas efektyviosios skysčių chromatografijos su masių spektrometrija (ESC-MS) metodu. Lydymosi temperatūra nustatyta Koflerio prietaisu. Tyrimo rezultatai: Išanalizavus duomenis nustatyta kad visi susintetinti MR junginiai mažina 10- formil 7,8-dihidrofolato (FFH2) kiekį, lyginant su kontrole. 83 % heterociklų veikia aktyviau į timidilato sintazę nei kontrolė, nustatytas deoksiuridino monofosfato (dUMP) padidėjimas. Be to, įvertinta, kad 92 % junginių sukelia 5 – aminoimidazolo – 4 – karboksiamido ribonukleotido (AICAR) padidėjimą lyginant su kontrole. Apibendrinus rezultatus nustatyta, jog penkianariai heterociklai, turintys sieros ir azoto atomus, statistiškai patikimai veikia į S. aureus bakterijų kultūrą: visuose sintezuotuose junginių mėginiuose FFH2 sumažėjo daugiau negu 3 kartus (log2(T/K)=3), dUMP - 3 karto (log2(T/K)=2.89), o AICAR padaugėjo ne mažiau kaip 2 karto (log2(T/K)=2.78), kai statistinis patikimumas p<0.001. Tyrimo išvados: Sintetinta 12 MR junginių, jų išeiga svyravo 50 – 93 %. Kiekvieno MR junginio struktūra patvirtinta PLC, UV , IR ir MS spektrinėmis analizėmis, o jų grynumas – ESC metodu, grynumas svyravo 90 – 95 %. Nustatyta, kad visi MR junginiai mažina FFH2 kiekį, lyginant su neigiama kontrole. Taip pat 83 % sintezuotų heterociklų didina dUMP kiekį. Nustatyta, kad 92 % junginių sukelia AICAR kiekio padidėjimą, lyginant su kontrole. MR – 12 junginys aktyviausiai jungiasi su baltymo 3qna (6- piruvoiltetrahidropterino sintaze) aktyviajame centre. Tyrimo rekomendacijos: atlikti detalesnius metabolitų pokyčių tyrimus, identifikuojant visų metabolitų pokyčius ir nustatyti junginių tikslų veikimo mechanizmą.

Magistro baigiamajame darbe buvo sintetinti izatino struktūros junginiai įvedant pakaitus į 1-ą,3-ią ir 5-ą padėtis ir ištirtas sintetintų junginių metabolitų pokytis veikiant S. aureus. Nustatytas, kad 94 % junginių mažino guanino kiekį lyginant su kontrole. Metiladenino kiekį sumažina 88 % junginių lyginant su kontrole. 55 % junginių padidina dTDP kiekį lyginant su kontrole. Atlikus in silico tyrimą nustatyta, potencialus slopinimo mechanizmas. Sintetinti junginiai sąveikauja su baltymo aktyviojo centro Tyr, Arg, Lys aminorūgštimis.