Balnytė, Ingrida

Suaugusiųjų glioblastoma (GBM) yra labai piktybinis smegenų navikas, kuriam vis dar ieškoma veiksmingo gydymo. Pradėjus gydymą, 70 proc. GBM atvejų progresuoja per pirmuosius metus, 5-erių metų išgyvenamumas yra vienas trumpiausių iš visų vėžio rūšių. GBM pacientų mirtingumą lemia gydymo temozolomidu (TMZ) neveiksmingumas arba įgytas atsparumas chemoterapijai. Darbas skirtas eksperimentiniais metodais ištirti natrio valproato ir natrio dichloroacetato derinio (NaVPA–NaDCA) poveikį GBM ląstelių linijų ir pacientų GBM pirminių ląstelių navikų raidai in vivo; patvirtinti hipotezę, kad NaVPA gali sustiprinti NaDCA poveikį, kuris pasireiškia derinio komponentų sinergizmu; viščiuko embriono chorioalantojinės membranos (CAM) modelis tinka nustatyti tiriamojo vaisto poveikiui ir galėtų būti taikomas vaisto veiksmingumui nustatyti prieš skiriant chemoterapiją. Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti NaVPA–NaDCA poveikį navikų, suformuotų iš U87 ir T98G ląstelių, augimui ant CAM, jų invazijai į mezenchimą, angiogenezei bei PLBA, p53 ir EZH2 raiškai navike, palyginti su NaDCA bei TMZ poveikiu. 2. Palyginti NaDCA, TMZ, NaVPA–NaDCA poveikį U87 ir T98G ląstelių SLC12A2, SLC12A5, SLC5A8, CDH1 ir CDH2 raiškai in vitro. 3. Nustatyti NaVPA–NaDCA poveikį pacientų GBM pirminių ląstelių navikams ant CAM, jų invazijai, angiogenezei bei GFRB, PLBA, p53, EZH2 ir vimentino raiškai. 4. Nustatyti NaVPA–NaDCA poveikį paciento pirminių GBM ląstelių SLC12A2, SLC12A5, SLC5A8, CDH1 ir CDH2 raiškai in vitro.

Santrauka Darbo pavadinimas: Plaučių adenokarcinomos ląstelių poveikis viščiuko embriono chorioalantojinės membranos morfologijai ir neoangiogenezei bei SOX2 ir HIF-1α genų įtaka šiems procesams. Autorius : Diana Miliauskaitė Vadovė: Prof. dr. Ingrida Balnytė Konsultantė: dr. Lina Šlekienė Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos fakultetas, Histologijos ir embriologijos katedra, Kaunas, 2026. Tyrimos tikslas: Įvertinti kontrolinės grupės, bei grupių su nuslopinta SOX2 ir HIF-1α genų raiška, poveikį chorioalantojinės membranos morfologiniams pokyčiams bei navikinių žymenų (p53, EZH2) raiškai auglyje, suformuotame iš plaučių navikinių ląstelių. Tyrimo uždaviniai:

1. Nustatyti ir įvertinti plaučių adenokarcinomos ląstelių suformuotų navikų invazyvumo į viščiuko chorioalantojinę membraną ir pačios membranos pokyčius po navikinių ląstelių užsodinimo praėjus 14–ai valandų ir trims paroms.
2. Ištirti ir histomorfometriškai įvertinti navikinių ląstelių, kurioms buvo užslopinti SOX2 ir HIF-1α genai, poveikį chorioalantojinės membranos morfologiniams pokyčiams ir neoangiogenezei po užsodinimo praėjus 14–ai valandų ir trims paroms.
3. Imunohistochemiškai įvertinti SOX2 ir HIF-1α genų poveikį suformuotų navikų p53 ir EZH2 raiškai. Tyrimo objektas: Tyrime buvo naudojama žmogaus plaučių adenokarcinomos ląstelių linija A549. Šios ląstelės buvo gautos iš Umeå universiteto, Švedijos, Medicininės ir transliacinės biologijos katedros (angl. Department of Medical and Translational Biology), bendradarbiaujant su prof. Lena Gunhaga tyrimų grupe. Pirminė A549 ląstelių linija buvo gauta iš American Type Culture Collection (ATCC). Tyrime naudotas viščiuko chorioalantojinės membranos (CAM) modelis. Tirtos trys A549 ląstelių grupės: kontrolinė WT grupė, grupė su slopinta SOX2 geno raiška bei grupė su slopinta HIF-1α geno raiška. Metodai: Mėginiai buvo imami praėjus 14–ai valandų ir trims paroms po navikinių ląstelių užsodinimo ant chorioalantojinės membranos. Tiriamoji medžiaga buvo analizuojama taikant histologinį dažymą hematoksilinu ir eozinu (H-E), kuriuo buvo vertinami CAM morfologiniai pokyčiai, neoangiogenezė ir invazyvumas. Imunohistocheminis metodas (IHC) buvo taikytas navikinių žymenų p53 ir EZH2 raiškos vertinimui. Tyrimo metu buvo stebimi navikinių ląstelių invazyvumo į CAM požymiai bei taikant histomorfometrinę analizę vertinami membranos storio ir kraujagyslių pokyčiai. Duomenų analizė atlikta naudojant ,,GraphPad Prism 8” programą, taikant dviejų veiksnių dispersinę analizę (angl. two-way ANOVA). Rezultatai ir išvados: Kokybinė histologinių CAM mėginių analizė parodė, kad praėjus trims paroms po navikinių ląstelių užsodinimo, CAM pasižymėjo ryškesniais morfologiniais pokyčiais, negu praėjus 14-ai valandų. Buvo stebima pakitusi CAM audinio struktūra, storesnė membrana naviko formavimosi srityje, savitas navikinių ląstelių įsiskverbimas į CAM mezenchimą. Šie pokyčiai nustatyti tiek kontrolinėje WT grupėje, tiek HIF-1α ir SOX2 grupėse. Šie rezultatai rodo, kad ilgėjant inkubacijos laikui navikinės ląstelės įgyja gebėjimą infiltruoti CAM, o izoliuotas HIF-1α ir SOX2 genų slopinimas neturi aiškiai išreikšto slopinančio poveikio navikinių ląstelių invazijai. Atlikus tolesnę histomorfometrinę analizę vertinant plaučių adenokarcinomos ląstelių poveikį CAM morfologijai ir neoangiogenezei nustatyta, kad HIF-1α geno slopinimas turėjo statistiškai reikšmingą poveikį tiek CAM storiui, tiek neoangiogenezei praėjus 3 paroms ir skyrėsi nuo 14 valandų laikotarpio. HIF-1α grupėje taip pat buvo stebėtas mažiausias kraujagyslių skaičius po 14 valandų ir didžiausias po 3 parų, tačiau šie skirtumai, lyginant su kontroline WT grupe, nebuvo statistiškai reikšmingi. Tuo tarpu SOX2 geno nuslopinimas reikšmingo poveikio neoangiogenezei ir CAM storiui neturėjo. Vertinant EZH2 raišką tirtų grupių ląstelių suformuotose navikuose pastebėtas statistiškai reikšmingas pokytis laiko atžvilgiu, visose tirtose grupėse EZH2 raiška buvo mažesnė praėjus 3 paroms lyginant su 14 valandų laikotarpiu. Tačiau izoliuotas HIF-1α ir SOX2 genų nuslopinimas poveikio EZH2 raiškai neturėjo. Vertinant p53 raišką, nustatytas statistiškai reikšmingas p53-teigiamų ląstelių sumažėjimas tik SOX2 grupėje, tiek po 14 valandų, tiek ir po 3 parų lyginant su kontroline WT grupe. HIF-1α geno slopinimas reikšmingo poveikio p53 raiškai neturėjo.

Darbo tikslas – nustatyti natrio dichloroacetato (DCA) poveikį U87 MG glioblastomos navikų augimui, invazijai naudojant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos (CAM) modelį. Darbe histomorfometriškai vertintas DCA poveikis CAM, imunohistochemiškai vertintas DCA poveikis ant CAM suformuoto U87 MG glioblastomos naviko ląstelių proliferacijai, mutantinio p53 ir EZH2 baltymų raiškai ir jų raiškos ryšys su naviko progresavimu. Tyrimui naudoti apvaisinti Cobb-500 veislės vištų kiaušiniai. 3-ią viščiuko embriono vystymosi parą kiaušinio lukšte buvo atidaryti langeliai, o 7-tą parą šalia stambiausios CAM kraujagyslės buvo persodintas suformuotas U87 MG glioblastomos ląstelių navikas. Tirtos trys eksperimentinės navikų grupės: 1) U87 MG negydyti kontroliniai glioblastomos ląstelių navikai, 2) gydytų 5 mM DCA ir 3) gydytų 10 mM DCA dozėmis U87 MG glioblastomos ląstelių navikai. Vertinant DCA poveikį U87 MG glioblastomos ląstelių navikams, 9–12 embriono vystymosi paromis buvo atlikti in vivo biomikroskopiniai tyrimai. Nustatyta, kad negydyti U87 MG ląstelių navikai sukėlė ryškią angiogenezę: apie suformuotą naviką išryškėjo kraujagyslių suformuotas „stipininis ratelis“; gydytų 5 mM DCA doze navikų angiogenezės slopinimas buvo ryškesnis, lyginant su 10 mM DCA grupe. Histomorfometriškai tirtose grupėse nustatytas DCA poveikis CAM, U87 MG negydytoje ir 10 mM DCA gydytoje navikų grupėje būdingas didžiausias chorioalantojinės membranos sustorėjimas (atitinkamai 219,1  91,67 µm ir 254,4  105,90 µm). Tai statistiškai patikimi rezultatai, lyginant su apvaisintų kiaušinių kontroline grupe (ant CAM nepersodintas navikas), p < 0,0001. CAM sustorėjimas susijęs su „pūslelių“ atsiradimu choriono epitelyje ir tankesne mezenchima. U87 MG kontrolinei negydytų navikų grupei būdingas didžiausias membranos mezenchimos sutankėjimas. Apvaisintų kiaušinių kontrolinėje grupėje (ant CAM nepersodintas navikas) pūslelių neaptikta. Histomorfometriškai įvertinus CAM epitelio vientisumą, nustatyta, kad U87 MG glioblastomos ląstelės pasižymi aukšta invazyvumo geba. Invazija kontrolinėje U87 MG grupėje nustatyta 88 proc. tirtų atvejų. U87 MG 5 mM DCA grupėje invazija į CAM buvo 7,20 proc. atvejų, t.y statistiškai patikimai sumažėjo (p = 0,0001), U87 MG 10 mM DCA grupėje – 50 proc., t.y. statistiškai patikimai sumažėjo (p = 0,044). U87 MG ląsteles paveikus 5 mM DCA ar 10 mM DCA doze, mutantinių p53-teigiamų ląstelių raiška sumažėja: 5 mM DCA grupėje ji siekė 12  6,26 proc., o 10 mM DCA – 14  12,89 proc, t.y. statistiškai patikimas sumažėjimas lyginant su U87 MG kontroline grupe (atitinkamai, p = 0,008 ir p = 0,017). Lyginant su U87 MG kontrole, EZH2 raiška navike, paveikus DCA, mažėjo: 5 mM DCA grupėje EZH2-teigiamų ląstelių buvo 11  14 proc. visų ląstelių navike (p = 0,004 ), o 10 mM DCA grupėje – 30  25,79 proc. (p > 0,05). U87 MG ląstelių proliferacija tirtų DCA dozių poveikyje sumažėja: 5 mM DCA grupėje PLBA-teigiamų ląstelių buvo 20  7,3 proc. visų ląstelių navike, o 10 Mm DCA grupėje – 21  17 proc., t.y. statistiškai patikimai sumažėjo (atitinkamai p = 0,000 ir p = 0,002). Tyrimas parodė, kad U87 glioblastomos navikų invazyvumas į CAM statistiškai patikimai sumažėjo DCA poveikyje. 5 mM ir 10 mM DCA dozės slopino U87 MG glioblastomos ląstelių navikų augimą ant CAM ir neoengiogenezę. Nustatytas naviko, o taip pat ir DCA, poveikis CAM storiui, mezenchimos tankiui. Su naviko ksenotransplantacija susijęs pūslelių atsiradimas choriono epitelio srityje. DCA slopina naviko ląstelių proliferaciją, mutantinio p53 ir EZH2 baltymų raišką gydytų tirtomis DCA dozėmis U87 MG glioblastomos ląstelių navikuose, lyginant su negydytų DCA ląstelių grupe, ir slopina naviko progresavimą.

Magistro darbo autorius: Laura Ribokaitė Magistro darbo pavadinimas: GLIOBLASTOMOS U87 MG LĄSTELIŲ NAVIKŲ RAIDOS ANT VIŠČIUKO EMBRIONO CHORIOALANTOJINĖS MEMBRANOS PAVEIKUS NATRIO DICHLOROACETATO IR NATRIO VALPROATO DERINIU HISTOLOGINIS IR IMUNOHISTOCHEMINIS TYRIMAS Glioblastoma yra labiausiai paplitusi, agresyviausia difuzinė gliomos forma, atspari įprastiems gydymo būdams. Tyrimo tikslas – ištirti natrio dichloroacetato (DCA) ir natrio valproato (NaVP) derinio (DCA–NaVP) poveikį U87 MG naviko raidai, invazijai į viščiuko chorioalantojinę membraną (CAM), taikant histologinio ir imunohistocheminio tyrimo metodus. Buvo tiriamas dviejų DCA–NaVP dozių poveikis glioblastomos navikams. Tyrimo metu naudoti apvaisinti Cobb500 vištos kiaušiniai. Taikant CAM modelį buvo tirtos trys navikų grupės – 1) U87 MG (negydytų navikų kontrolinė grupė), 2) U87 MG gydytų 2 mM NaVP–5 mM DCA doze ir 3) U87 MG gydytų 4 mM NaVP–5 mM DCA doze grupės. 9–12 viščiuko embriono vystymosi paromis buvo vertinamas ant CAM užsodinto naviko raida (naviko augimas, invazija į CAM ir angiogenezė). U87 MG navikai pasižymėjo išreikšta angiogeneze, kraujagyslėms suformuojant „stipininį ratelį“. Angiogenezės reikšmingas slopinimas nustatytas tik ląsteles paveikus 4 mM NaVP–5 mM DCA deriniu. Lyginant naviko invazijos dažnį į CAM tirtose grupėse, nustatyta, kad U87 MG ląsteles paveikus NaVP–DCA dviem skirtingomis dozėmis, invazija sumažėjo daugiau nei 5 kartus, lyginant su U87 MG kontroline grupe (p < 0,0001). Reikšmingo invazijos į CAM dažnio skirtumo, lyginant gydytų skirtingais deriniais grupes, nenustatyta (p > 0,05). Nustatyti gydymo poveikio CAM storiui pokyčiai: U87 MG grupėje CAM pastorėjo 5 kartus lyginant su apvaisinto kiaušinio CAM kontrolineje grupeje (p < 0,0001). U87 MG ląsteles paveikus 4 mM NaVP–5 mM DCA doze CAM storis sumažėjo 2 kartus, lyginant su U87 MG kontroline grupe (p = 0,03). Imunohistocheminė PLBA raiškos analizė parodė, kad U87 MG naviko grupėje būdinga stipresnė PLBA raiška nei gydytų DCA–NAVP deriniais (p > 0,05). Visų grupių CAM buvo tirta vimentino ir E-kadherino raiška, tikslu nustatyti mezenchiminiam ir epiteliniam fenotipui, vertintas vimentino-teigiamų ląstelių užimamas plotas navike. Ryškiausia vimentino raiška ir didžiausias vimentino-teigiamų ląstelių užimamas plotas nustatytas U87 MG navikų grupėje. Paveikus DCA–NAVP, vimentino raiška sumažėjo, lyginant su U87 MG kontroline grupe, o paveikus 2 mM NaVP–5 mM DCA ir 4 mM NaVP–5 mM DCA, vimentino teigiamų ląstelių užimamas plotas sumažėjo statistiškai patikimai (p < 0,0001). E-kadherino raiška 4 mM NaVP–5 mM DCA grupėje buvo didesnė nei gydytų 2 mM NaVP–5 mM DCA grupėje.

Tyrimo tikslas: ištirti endometriumo audinių proliferacijos intensyvumą žymeniu Ki-67 pomenopauzės laikotarpiu ir palyginti gautus rezultatus pacienčių amžiaus ir kitų klinikinių duomenų atžvilgiu. Uždaviniai. 1. Nustatyti Ki-67 teigiamai nusidažiusių epitelinių ląstelių procentą endometriumo epiteliniame audinyje. 2. Nustatyti Ki-67 teigiamai nusidažiusių jungiamojo audinio ląstelių procentą endometriumo jungiamajame audinyje. 3. Apskaičiuoti endometriumo audinių bendrąjį proliferacijos indeksą ir palyginti su turimais anamnezės duomenimis. Tyrimo objektai ir metodai: histologiniai pomenopauzinio amžiaus moterų, neturėjusių ginekologinių nusiskundimų, endometriumo polipų pjūviai (n=49) dažyti imunohistochemiškai naudojant monokloninius pelės antikūnius prieš žmogaus Ki-67 antigeną ((MIB-1, Dako, 1:100) ir EnVision vizualizavimo sistemą. Didžiuoju mikroskopo didinimu, skaitmeniniu būdu dokumentuota po dešimt regėjimo laukų kiekviename preparate ir atliktas nusidažiusių ir nenusidažiusių, endometriumo epitelinių ir jungiamojo audinio ląstelių skaičiavimas akimis ir naudojant Mousotron programėlę. Iš gautų duomenų apskaičiuotas kiekvieno audinio audinio atskirai ir bendrasis proliferacijos indeksas, jie palyginti su klinikiniais ir anamnezės duomenimis. Statistinio pasikliovimo lygmuo pasirinktas 95 proc., kai p < 0,05. Tyrimo rezultatai. Ištirta 49 moterų endometriumo histologinių pjūvių, dažytų anti-Ki-67 antikūniais, ir suskaičiuotas epitelinio ir jungiamojo audinio besidauginančios ląsteles, apskaičiuotas jų proliferacijos indeksas. Nustatyta, kad epitelinio audinio ląstelių proliferacijos indeksas (EPI) buvo didesnis už jungiamojo audinio ląstelių proliferacijos indeksą (JPI), atitinkamai jų medianos buvo 4,8 ir 0,9, p < 0,05. Nustatyta vidutinio stiprumo koreliacija tarp EPI ir JPI, r = 0,613, p < 0,01. Tiriant sąsajas su amžiumi, pastebėta tendencija, kad bendrasis proliferacijos indeksas ir EPI yra didesnis jaunesniojo pomenopauzinio laikotarpio moterims. Išvados: Pomenopauzės laikotarpiu dauginasi endometriumo ir epitelinės, ir jungiamojo audinio ląstelės. Bendrojo proliferacijos indekso statistiškai patikimų sąsajų su klinikiniais ir anamnezės duomenimis nenustatyta, tačiau pastebėta tendencija, kad EPI ir BPI yra didesni jaunesniojo pomenopauzinio laikotarpio nutukusioms moterims.

Šio tyrimo tikslas buvo įvertinti užkrūčio liaukos Hasalio kūnelių kitimus, susijusius su lytiniais hormonais ir paveikus Natrio valproatu (NaVp) eksperimento sąlygomis.