Šaltenienė, Violeta

Magistro darbo autorius: Tomas Muškieta Magistro darbo pavadinimas: Sergančiųjų opiniu kolitu imunofenotipas ir jo sąsaja su ligos klinikiniais rodikliais

Šio magistrinio darbo tikslas buvo ištirti opiniu kolitu sergančių pacientų imunofenotipą iš kraujo ir įvertinti jo ryšį su ligos klinikiniais rodikliais. Šiam tikslui pasiekti buvo iškelti keturi uždaviniai: (i) Nustatyti imunofenotipo pokyčius, susijusius su opiniu kolitu, esant aktyviai ligos formai ir remisijai; (ii) Palyginti opiniu kolitu sergančių pacientų, gydytų biologine terapija, mesalazinu ir azatioprinu, imunofenotipus; (iii) Įvertinti opiniu kolitu sergančių pacientų imuninio profilio sąsają su ligos sunkumu; (iv) Įvertinti leukocitų subpopuliacijų tarpusavio koreliaciją su opinio kolito endoskopiniu aktyvumu. Tyrimo metu buvo atlikta kraujo imunofenotipo palyginamoji analizė pacientų sergančių aktyviu opiniu kolitu (n = 15), esančių remisijoje (n = 18) ir neturinčių virškinimo sistemos ligų (kontrolinė grupė) (n = 17), kraujyje. Imunofenotipo skirtumai įvertinti ir pagal ligos aktyvumą bei sunkumą. Be to, atlikta palyginamoji imunofenotipo analizė pacientų gydytų biologine terapija, azatioprinu ir mesalazinu grupėse. Kraujo ląstelės buvo išgrynintos naudojant tankio gradientą su reagentu „ Ficoll-Paque PREMIUM“ (Cytiva). Imunofenotipo analizė atlikta naudojant citometrą „BD FACSMelody“ ir programinę įrangą „BD FACSChorus™“. Statistiniai skaičiavimai ir rezultatų analizė buvo atlikta naudojant „RStudio“ programinę įrangą. Atlikus tyrimą buvo nustatyta, kad aktyviu opiniu kolitu sergančių pacientų kraujyje T limfocitų (CD3+) buvo 1,3 karto mažiau (28,2 proc., p = 0,033), palyginus su kontrole (36 proc.). Neutrofilų (CD16+_CD56+) buvo 1,3 karto daugiau (56,6 proc., p = 0,005), palyginus su kontrole (44,6 proc.). Natūraliųjų ląstelių žudikių (CD56+) buvo mažiau 1,6 karto (5,4 proc., p = 0,041), palyginus su kontrole (8,8 proc.). Aktyvaus opinio kolito grupėje imunofenotipo skirtumo tarp gydytų biologine terapija, mesalazinu ir azatioprinu nenustatyta. Opinio kolito remisijos metu T limfocitų (CD3+) buvo 1,3 karto mažiau (27,1 proc., p = 0,034), palyginus su kontrole (36 proc.). T pagalbininkų Th2 ir Th17 buvo 3,1 (17,7 proc., p = 0,041) ir 5,9 (6,5 proc., p = 0,04) kartus daugiau, atitinkamai, palyginus su kontrole (5,7 proc.). Neutrofilų (CD16+_CD56+) buvo 1,3 karto daugiau (55,8 proc., p = 0,029), palyginus su kontrole (44,6 proc.). Monocitų (CD14+) buvo 1,3 karto daugiau (7,3 proc., p = 0,022), palyginus su kontrole (5,8 proc.). Pagal gydymą azatioprinu opinio kolito remisijos grupės pacientų kraujyje natūraliųjų ląstelių žudikių (NK) buvo mažiau 2,2 kartus (3,5 proc., p = 0,032), palyginus su negydytais (7,8 proc.). Tuo tarpu, tarp gydytų biologine terapija ir mesalazino imunofenotipo skirtumo nenustatyta. Taip pat nebuvo nustatyta ir leukocitų subpopuliacijų tarpusavio koreliacija su ligos sunkumu pagal pilną Mayo balą ir endoskopinį Mayo įvertį. Apibendrinant rezultatus buvo padarytos išvados: pacientų, sergančiųjų aktyviu opiniu kolitu kraujyje, palyginus su kontrole, nustatyta reikšmingai mažiau T limfocitų ir natūralių ląstelių žudikių, o neutrofilų – daugiau. Tuo tarpu opinio kolito remisijoje esančių pacientų kraujyje, palyginus su kontrole, nustatyta reikšmingai mažiau T limfocitų, o monocitų, neutrofilų bei T pagalbininkų 2 ir 17 (Th2, Th17) – daugiau; Pacientų, esančių opinio kolito remisijoje ir gydytų azatioprinu, kraujyje, palyginus su negydytais asmenimis, nustatyta reikšmingai mažiau natūraliųjų ląstelių žudikių. Tačiau, gydymas biologine terapija ir mesalazinu reikšmingos įtakos aktyvaus opinio kolito ir esančių ligos remisijoje pacientų kraujo imunofenotipui neturėjo; Imunofenotipo sąsajų su opinio kolito sunkumu (pilnu Mayo balu) nebuvo nustatyta; Leukocitų subpopuliacijų tarpusavio koreliacijos su endoskopiniu opinio kolito aktyvumu (endoskopiniu Mayo įverčiu) nebuvo nustatyta.

Bakalauro baigiamojo darbo tikslas: Įvertinti lipopolischarido įtaką citokinus koduojančių genų raiškai storosios žarnos ląstelėse. Šiam tikslui įgyvendinti buvo iškelti du uždaviniai:

1. Nustatyti Toll baltymo 4 receptoriaus (TLR4) geno raiškos pokyčius po 24 val. stimuliacijos 1 ir 10 μg/ml Salmonella enterica lipopolisacharido tirpalu storosios žarnos epitelinėse HCoEpic ir adenokarcinomos HCT116 ląstelėse, trijuose laiko taškuose (po 24, 48 ir 72 val.)
2. Nustatyti citokinų TNF-alfa, IL-beta, IL-6, IL-10 ir IL-17A genų raiškos pokyčius storosios žarnos epitelinėse HCoEpic ir adenokarcinomos HCT116 ląstelėse po poveikio 1 ug/ml ir 10 ug/ml Salmonella enterica lipopolisacharido tirpalu, trijuose laiko taškuose (po 24, 48 ir 72 val.) Tyrimo objektas – citokinų genų raiškos pokyčiai in vitro po lipopolisacharido poveikio. Šiame darbe genų raiška buvo atlikta kiekybinio TL-PGR metodu naudojant Sybrgreen pradmenis. Atlikus genų raiškos analizę Livak metodu buvo nustatyta, kad Toll baltymo 4 receptoriaus (TLR4) geno raiška po 24 val. stimuliacijos 10 μg/ml lipopolisacharido tirpalu ląstelėse HCoEpiC padidėjo po 72 val. Citokino TNF-α geno raiška padidėjo HCT116 ląstelėse po 24 val. stimuliacijos 1 μg/ml lipopolisacharido tirpalu. IL-10 geno raiška padidėjo HCT116 ląstelėse po 24 val. stimuliacijos 1 μg/ml ir po 48 ir 72 val. stimuliacijos 10 μg/ml lipopolisacharido tirpalu, IL-17A geno raiška padidėjo HCT116 ląstelėse po 72 val. paveikus 1 μg/ml ir po 24val. ir 72 val. paveikus 10 μg/ml lipopolisacharido tirpalu, IL-6 ir IL-beta genų raiškai stimuliacija įtakos neturėjo nei 1 μg/ml nei 10 μg/ml lipopolisacharido tirpalas. Apibendrinant galima teigti, kad 24 val. stimuliacija 1 ir 10 μg/ml Salmonella enterica lipopolisacharido tirpalu buvo nepakankama, kad reikšmingai pasikeistų citokinų (TNF-alfa, IL-beta, IL-6, IL-10 ir IL-17) genų raiška storosios žarnos ląstelėse. Tačiau rezultatų patvirtinimui turi būti atlikta daugiau tyrimų.

Tyrimo objektas su storosios žarnos vėžiu siejamos hsa-miR-125b-2-3p ir ISO-miR-125b_tc (hsa-miR-125b-2-3p izoforma be uracilo ir citozino 5’ gale) veikla storosios žarnos vėžio patogenezėje. Funkciniams ląstelių tyrimams (MTT, kolonijų formavimosi, ,,žaizdos gijimo‘‘, apoptozės ir nekrozės, proliferacijos tyrimams) naudotos komercinės storosios žarnos vėžio ląstelių linijos (Caco-2, SW620, HCT116). MiRNR ir genų taikinių sąsaja buvo tiriama, naudojantis liuciferazės vektoriumi paremta reporterine sistema modelinėse AGS ląstelių linijose. Tyrimo rezultatai – funkciniai ląstelių tyrimai parodė, kad eksperimentiškai užslopinus tiriamąsias miRNR inhibitoriais pakito vėžinių ląstelių funkcija. Užslopinus hsa-miR-125b-2-3p ir ISO-miR-125b_tc reikšmingai sumažėjo Caco-2 ir HCT116 ląstelių gyvybingumas ir migracija, o hsa-miR-125b-2-3p slopinimas padidino ankstyvos apoptozės ląstelių kiekį. Remiantis ,,miRDB‘‘ programa ir ,,PubMed‘‘ duomenų baze, atlikta in silico analizė, kurios metu nustatyti galimi hsa-miR-125b-2-3p ir ISO-miR-125b_tc genai taikiniai (PDZRN4 ir SCAI atitinkamai). Pasitelkus liuciferazės vektoriumi paremtą reporterinę sistemą, pirmą kartą patikrinta šių miRNR ir jų genų taikinių tiesioginė sąsaja, tačiau ryšys nebuvo nustatytas. Apibendrinant rezultatus, galima teigti, kad hsa-miR-125b-2-3p ir ISO-miR-125b_tc, veikdama kaip onkogeninė miRNR dalyvauja SŽV patogenezėje, tačiau reikalingi detalesni šių mikroRNR ir jų genų taikinių tyrimai.

Tyrimo objektas – su storosios žarnos vėžiu siejamos mikroRNR ir jos funkcijos tyrimas storosios žarnos vėžio patogenezėje. Komercinės storosios žarnos vėžio ląstelių linijos (Caco-2 ir SW620) buvo pasirinktos kaip sistema, tinkančios tyrimo objektui tyrinėti. Tyrimo rezultatai parodė, kad hsa-miR-1246 raiška buvo didesnė komercinėse storosios žarnos vėžio ląstelėse (Caco-2 ir SW620), palyginti su kontrole (storosios žarnos audinys). MiRNR ir genų taikinių tiesioginės sąsajos tyrimas, pasitelkiant liuciferazės vektoriumi paremtą reporterinę sistemą, parodė, kad CFTR (1537-1544 3' UTR) ir AXIN2 (313-320 3' UTR) genai yra tiesioginiai hsa-miR-1246 taikiniai. Atlikus CFTR ir AXIN2 genų taikinių raiškos tyrimą komercinių storosios žarnos vėžio ląstelių linijose (Caco-2 ir SW620), praėjus 48 val. po transfekcijos hsa-miR-1246 imitatoriumi, buvo nustatyta, kad šių genų raiška sumažėjo. Komercinių storosios žarnos vėžio ląstelių linijose (Caco-2 ir SW620), praėjus 72 val. po transfekcijos hsa-miR-1246 imitatoriumi, CFTR ir AXIN2 baltymų raiškos pokyčio nebuvo. Šio tyrimo metu, liuciferazės reporteriniu vektoriumi paremta sistema, pirmą kartą buvo nustatyta, tiesioginė hsa-miR-1246 ir genų CFTR bei AXIN2 sąsaja. Be to, hsa-miR-1246 epigenetinis poveikis CFTR bei AXIN2 genų raiškai.