Išemijos/reperfuzijos poveikio žmogaus inkstų proksimalinių kanalėlių ląstelėms tyrimas

Magistro baigiamojo darbo autorius. Aušra Mieldažytė Tema. Išemijos/reperfuzijos poveikio žmogaus inkstų proksimalinių kanalėlių ląstelėms tyrimas. Mokslinis vadovas. prof. dr. Rasa Banienė; Konsultantas. asist. Arvydas Strazdauskas Atlikimo vieta. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Biochemijos katedra. Darbo tikslas. Įvertinti išemijos/reperfuzijos įtaką žmogaus inkstų proksimalinių kanalėlių ląstelių metaboliniams pokyčiams. Tyrimo objektas. Žmogaus inkstų proksimalinių kanalėlių epitelinių ląstelių (RPTEC/TERT1) linija. Darbo uždaviniai: 1. Įvertinti išemijos/reperfuzijos poveikį žmogaus inkstų proksimalinių kanalėlių gyvybingumui ir proliferacijai; 2. Įvertinti išemijos/reperfuzijos poveikį žmogaus inkstų proksimalinių kanalėlių ląstelių energetikai; 3. Įvertinti išemijos/reperfuzijos poveikį žmogaus inkstų proksimalinių kanalėlių glikolitiniam aktyvumui, hipoksijos indukuojamo veiksnio ir reaktyvių deguonies junginių koncentracijų pokyčiams. Metodai. Ląstelių kultūroms in vitro 37°C sukeliama išemija panaudojant glikolizės slopiklį ir patalpinant ląsteles 24 val. į hipoksijos kamerą (2 proc. O2, 37°C), po to vykdoma 24 val. ir 48 val. reperfuzija pakeičiant šviežią terpę ir laikant ląsteles įprastomis sąlygomis. Ląstelių gyvybingumas vertinamas fluorescencinės mikroskopijos metodu. Mitochondrijų funkcijos ir ląstelių glikolitinis aktyvumas vertinamas oksigrafu – Oxygraph-2k. Reaktyvių deguonies junginių koncentracija matuojama fluorimetriniu metodu. HIF-1α baltymo koncentracija matuojama ELISA metodu. Rezultatai. Išemija/reperfuzija slopino RPTEC ląstelių linijos proliferaciją, o poveikis ląstelių gyvybingumui išryškėjo tik prailginus reperfuziją iki 48 val. Įvertinus mitochondrijų funkcijos pažeidimą, nustatyta, kad 24 val. išemija slopino mitochondrijų funkcijas, kurios po reperfuzijos atsistatė iki kontrolės lygio. Taip pat nustatyta, kad 24 val. išemija slopino mitochondrijų funkcijas laidumo būsenoje, tačiau prailginus reperfuzijos laiką iki 48 val. mitochondrijų funkcija neatsistato, bet mitochondrijų vidinės ir išorinės membranos laidumas nepakito. ROS sintezė ląstelėse suintensyvėjo po reperfuzijos. Išemija nesukėlė HIF-1α koncentracijos pokyčių ir sumažino glikolitinį aktyvumą, o reperfuzija 24 ir 48 val. padidino HIF-1α baltymo koncentraciją ir stimuliavo glikolitinį aktyvumą. Išvados: 1. Išemija/reperfuzija slopino RPTEC ląstelių proliferaciją. Išemija neturėjo įtakos ląstelių gyvybingumui, bet 48 val. reperfuzija reikšmingai padidino nekrotinių ląstelių skaičių; 2. Išemija slopino RPTEC ląstelių mitochondrijų funkcijas, kurios po reperfuzijos atsistatė iki kontrolės lygio; 3. Išemija nesukėlė HIF-1α baltymo koncentracijos pokyčių ir sumažino ląstelių glikolitinį aktyvumą, o reperfuzija 24 ir 48 val. padidino HIF-1α baltymo koncentraciją ir didino glikolitinį aktyvumą; 4. Išemija neturėjo įtakos ROS sintezei, tačiau 24 ir 48 val. reperfuzija aktyvino ROS sintezę ląstelėje.

Author of Master thesis. Aušra Mieldažytė Title. Assessment of the Effect of Ischemia/Reperfusion on Human Renal Proximal Tubular Cells. Supervisor. prof. dr. Rasa Banienė; Consultant. assistant Arvydas Strazdauskas The aim of investigation. Evaluate the effect of ischemia/reperfusion on the metabolic changes of human renal proximal tubular cells. Work was performed at. Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Medicine, Department of Biochemistry. The object of investigation. Human renal proximal tubular epithelial cell line (RPTEC/TERT1). The objectives of the study: 1. To evaluate the effect of ischemia/reperfusion on the viability and proliferation of human renal proximal tubular cells; 2. To assess the effect of ischemia/reperfusion on the energy metabolism of human renal proximal tubular cells; 3. To assess the effect of ischemia/reperfusion on glycolytic activity, levels of hypoxia-inducible factor and reactive oxygen species generation in human renal proximal tubular cells. Methods. In vitro ischemia was induced using a glycolysis inhibitor and placing the RPTEC cultures in a hypoxic chamber for 24 h at 2 % O2, 37°C, followed by 24 h or 48 h reperfusion by placing the cultures in normal growth conditions with fresh growth medium. Cell viability was assessed by fluorescence microscopy. Mitochondrial functions and glycolytic activity were assessed by oxygraphic method using Oroboros Oxygraph-2k. Reactive oxygen species generation was measured by the fluorometric method. HIF-1α protein levels were assessed by ELISA method. Results. Ischemia/reperfusion inhibited proliferation of RPTEC cells and reduced cells viability only after 48 h of reperfusion. 24 h ischemia inhibited mitochondrial functions, which recovered to control levels after reperfusion. Moreover, 24 h ischemia inhibited mitochondrial respiration in the proton leak state, but prolonging reperfusion to 48 h did not restore it. Mitochondrial inner and outer membrane permeability was not affected. ROS generation was not affected by ischemia but was elevated after reperfusion. HIF-1α protein levels were not affected by ischemia, and cellular glycolytic activity decreased; however, it increased during reperfusion along with HIF-1α protein levels. Conclusions: 1. Ischemia/reperfusion inhibited the proliferation of RPTEC cells. Ischemia did not affect RPTEC cell viability; however, 48 h reperfusion significantly increased the number of necrotic cells; 2. Ischemia inhibited RPTEC cell mitochondrial functions, which recovered to control levels after reperfusion; 3. Ischemia did not affect HIF-1α protein levels and decreased cellular glycolytic activity; however, it was increased after reperfusion at 24 h and 48 h along with HIF-1α protein levels; 4. ROS generation in RPTEC cells was not affected by ischemia, but reperfusion significantly increased ROS generation after 24 h and 48 h of reperfusion.