KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS (10)

Darbo tikslas. Įvertinti propofolio poveikį kraujagyslių koneksino-37 puskanalių biofizikinėms savybėms. Darbo uždaviniai:

1. Įvertinti propofolio poveikį viduląstelinio Ca2+ koncentracijos pokyčiams.
2. Ištirti koneksino-37 puskanalių laidumo priklausomybę nuo propofolio koncentracijos.
3. Ištirti propofolio poveikį koneksino-37 puskanalių laidumo priklausomybei nuo įtampos. Tyrimo objektas ir metodai. Eksperimentai buvo atlikti naudojant HeLa ląstelių liniją, pasižyminčią stabilia koneksino-37 raiška. Propofolio poveikis viduląstelinio Ca2+ koncentracijos pokyčiams buvo vertinamas taikant fluorescencijos intensyvumo matavimus, naudojant Ca2+ ląstelės viduje surišantį fluorescencinį dažą Fluo-4. Siekiant ištirti biofizikines koneksino-37 formuojamų puskanalių savybes, buvo naudojamas fiksuotos įtampos metodas (angl. patch-clamp), kuris pagrįstas tiesioginiu elektrinių signalų matavimu ląstelėje. Tyrimo rezultatai. Šiame darbe atlikti viduląstelinės Ca²⁺ koncentracijos [Ca²⁺]i matavimo tyrimai atskleidė, kad propofolis priklausomai nuo koncentracijos didina [Ca²⁺]i laukinio tipo (WT) HeLa ląstelėse nepasižyminčiose Cx37 raiška. Propofolio koncentracijos, kurios yra mažesnės nei 35 µM, [Ca²⁺]i reikšmingai nedidina, tačiau reikšmingas [Ca²⁺]i padidėjimas pastebėtas naudojant 60 µM ir didesnes propofolio koncentracijas. [Ca²⁺]i nepriklausė nuo propofolio poveikio laiko HeLa WT ląstelėms. Elektrofiziologiniai tyrimai parodė, propofolio slopinamąjį poveikį Cx37 puskanalių laidumui. Mūsų rezultatai rodo, kad didinant propofolio koncentraciją, Cx37 puskanalių laidumas mažėja. Tuo tarpu tiriant laidumo priklausomybę nuo įtampos, įtakos turėjo tik 5 µM propofolio koncentracija, kuri pasižymi nedideliu slopinamuoju poveikiu Cx37 puskanalių laidumui, tačiau 90 µM propofolio koncentracija, kuri Cx37 puskanalių laidumą slopino ~4 kartus daugiau, jų laidumo priklausomybės nuo įtampos nepaveikė.

Širdies nepakankamumas (ŠN) yra klinikinis sindromas, pasireiškiantis susilpnėjusia širdies funkcija dėl struktūrinių ir funkcinių pažeidimų. ŠN patogeneziniai mechanizmai yra plačiai apibūdinti, tačiau kardiomiocitų ankstyvieji kompensaciniai struktūriniai pakitimai dar nėra pakankamai ištirti. Įvertinus kardiomiocitų įtaką širdies raumens remodeliavimosi procesui ir šiose ląstelėse vykstančius baltymų raiškos persitvarkymus, vis daugiau dėmesio skiriama diagnostikos kriterijų ir žymenų, atspindinčių širdies raumens persitvarkymo metu vykstančių baltymų raiškos dinamiką ir sąsajas su kardiomiocitų formos bei funkcijos pokyčiais, paieškai. Atlikus detalų morfometrinį ir imunohistocheminį širdies kairiojo skilvelio tyrimą, pirmą kartą pateikiama kardiomiocitų struktūrinių pokyčių įvairovė, detaliai apibūdinami kardiomiocitų citoskeleto tarpinio filamento desmino, osteopontino, gremlino 1 ir iRNR potranskripcinį brendimą reguliuojančio heterogeninio ribonukleoproteino C raiškos pokyčiai remodeliavimosi metu, kai buvo A, B ir C–D stadijų išeminės kilmės ŠN pagal Amerikos kardiologijos kolegijos / Amerikos širdies asociacijos klasifikaciją. Išsamių morfometrinio ir imunohistocheminio kardiomiocitų tyrimų rezultatais įrodyta kardiomiocitų remodeliavimosi svarba išeminės kilmės ŠN patogenezei dar iki atsirandant pirmiesiems ŠN simptomams. Šie rezultatai gali būti taikomi ieškant naujų ŠN diagnostikos ir gydymo taikinių.

Darbo tikslas: įvertinti žmogaus glioblastomos ląstelių išskiriamų užląstelinių pūslelių poveikį kraujagyslių endotelio ir kardiomiocitų funkcionalumui. Darbo uždaviniai: 1) Išskirti glioblastomos ląstelių sekretuojamas užląstelinių pūslelių skirtingas populiacijas bei identifikuoti jas pagal dydį ir charakteristikas; 2) Nustatyti ir palyginti glioblastomos užląstelinių pūslelių skirtingų frakcijų poveikį endotelio ląstelių migracijai ir metaboliniam aktyvumui; 3) Įvertinti glioblastomos užląstelinių pūslelių skirtingų populiacijų svarbą kraujagyslių endotelio ląstelių ir kardiomiocitų mitochondrijų funkcijai. Tyrimo medžiaga: Žmogaus glioblastomos ląstelių linija (HROG36), žmogaus virkštelės venos endotelio ląstelės (HUVEC), pirminė Wistar veislės 4-5 dienų amžiaus žiurkių kardiomiocitų kultūra, glioblastomos sekretuojamos užląstelinės pūslelės. Metodai: ląstelių kultivavimas, kardiomiocitų kultūros išskyrimas, ląstelių skaičiaus nustatymas Tripano mėliu, HROG36 užląstelinių pūslelių (UP) išskyrimas polimerinio išsodinimo bei centrifugavimo metodu, baltymo kiekio nustatymas spektrofotometriniu Bradford metodu, RNR išskyrimas TRIzol™ reagentu, nanodalelių sekimo ir dinaminės šviesos sklaidos metodai dalelių dydžio ir skaičiaus nustatymui, HUVEC ir kardiomiocitų mitochondrijų funkcijos vertinimas Seahorse XFp analizatoriumi bei metabolizmo įvertinimas PrestoBlue dažu. HUVEC migracijos įvertinimas in vitro žaizdos metodu. Rezultatai ir išvados: mažų HROG36 UP dydis buvo nuo 13,54 nm iki 450 nm, kai didelio dydžio UP buvo tarp 13,5 nm ir 1281 nm. Mažų UP populiacijoje nustatytas didesnis baltymo ir mažesnis RNR kiekis, palyginus su didelių UP populiacija. Mažos ir didelės HROG36 UP reikšmingai sumažino HUVEC metabolinį aktyvumą, nuslopino ląstelių migracijos potencialą bei mitochondrijų funkciją. Priešingai, abi HROG36 UP populiacijos aktyvino kardiomiocitų metabolizmą ir mitochondrijų kvėpavimą.

Bakalauro baigiamojo darbo autorius: Fausta Borusevičiūtė; Bakalauro baigiamasis darbas: Furano junginių įtaka žiurkės arteriniam kraujo spaudimui ir mitochondrijų funkcijoms; Mokslinė vadovė: dr. Irma Martišienė; Konsultantė: Jurgita Šapauskienė Atlikimo vieta: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Kardiologijos institutas, Membranų biofizikos laboratorija.

Tyrimo tikslas: Nustatyti furano žiedą turinčių junginių, 2-acetilfurano (2AF) ir 5-metilfurfuralio (5MFF), poveikį žiurkės arteriniam kraujo spaudimui ir mitochondrijų funkcijoms.

Tyrimo uždaviniai: 1. Nustatyti 2AF ir 5MFF įtaką žiurkės arteriniam kraujo spaudimui; 2. Įvertinti 2AF ir 5MFF poveikį žiurkės prostatos mitochondrijų oksidaciniam fosforilinimui; 3. Įvertinti 2AF ir 5MFF poveikį žiurkės kepenų mitochondrijų oksidaciniam fosforilinimui.

Tyrimo metodai: Žiurkės arterinis kraujo spaudimo matavimas invazyviu metodu in vivo; žiurkės kepenų mitochondrijų išskyrimas diferencinio centrifugavimo metodu; prostatos homogenato paruošimas; baltymo kiekio nustatymas modifikuotu Biureto metodu; mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas respirometriniu metodu.

Rezultatai: Furano junginiai, 2AF ir 5MFF, slopino žiurkės sistolinį ir diastolinį kraujo spaudimą in vivo. Suleidus 2AF ar 5MFF į pilvo ertmę (0,3 µl/g), sistolinis kraujo spaudimas sumažėjo atitinkamai 38 % ir 30 %, diastolinis kraujo spaudimas - atitinkamai 46 % ir 38 %. Nustatyta, kad veikiant 5MFF širdies ritmas padidėjo 10 %, o veikiant 2AF - sumažėjo 11 %. Registruojant 2AF ir 5MFF (0,3 µl/ml) poveikį mitochondrijų funkcijoms, nustatyta, kad tirtos medžiagos neturėjo statistiškai reikšmingo pokyčio prostatos mitochondrijų oksidacinio fosforilinimui, nekeitė vidinės ir išorinės mitochondrijų membranų pralaidumo. Tiriant medžiagų poveikį kepenų mitochondrijų funkcijoms, nustatyta kad 2AF ir 5MFF slopino
mitochondrijų oksidacinį fosforilinimą: a) oksidacinio fosforilinimo greitis (P(CI)) sumažėjo atitinkamai 64 % ir 67 %; b) maksimalus oksidacinio fosforilinimo greitis (P(CI+II)) sumažėjo atitinkamai 53 % ir 47 %; c) kvėpavimo kontrolės koeficientas (P(CI)/L(Glu+Mal)) sumažėjo atitinkamai 44 % ir 30 %, o (P(CI+II)/L(CAT)) sumažėjo atitinkamai 56 % ir 54 %; d) citochromo c efektas padidėjo atitinkamai 37 % ir 20 %.

Išvados: 1) Furano junginiai 2AF ir 5MFF mažino žiurkės arterinį kraujo spaudimą. Abiejų tirtų medžiagų poveikis buvo panašus tiek sistoliniam, tiek diastoliniam kraujo spaudimui. 2) 2AF ir 5MFF neturėjo statistiškai reikšmingo poveikio žiurkės prostatos mitochondrijų oksidaciniam fosforilinimui. 3) 2AF ir 5MFF slopino žiurkės kepenų mitochondrijų kvėpavimo greičius oksiduojant glutamatą/malatą ir sukcinatą visose metabolinėse būsenose bei padidino išorinės membranos pralaidumą.

Yra nustatyta, kad žmogaus monocitų kultūros, paveiktos LPS ir oksiduotais mažo tankio lipoproteinais (MTL), pradeda sintetinti citokinus. Taip pat yra rasta, kad oksiduoti MTL žmogaus organizme sukelia uždegimines reakcijas. Šio darbo metu buvo vertinama, ar oksiduoti MTL žmogaus monocitų kultūrą skatina sekretuoti uždegiminius citokinus, kokį poveikį turi ląstelių proliferacijai, ir ar ilgesnė poveikio trukmė ir didesnė oksiduotų MTL koncentracija monocitų kultūrą stimuliuotų stipriau. Darbas buvo atliktas naudojantis U937 linijos monocitų ląstelėmis kaip in vitro modeliu. PMA, LPS ir oksiduotų MTL sukelti poveikiai ląstelių išskiriamiems citokinams buvo vertinami nustatant išsiskyrusių TNF ir IL-6 koncentracijas ELISA metodu. Medžiagų įtaka ląstelių proliferacijai buvo vertinama atlikus citocheminį ląstelių dažymą Millipore Guava EasyCyte HT tėkmės citometru, o fluorescencija buvo stebima STEDYCON mikroskopu. Atlikus šiuos tyrimus buvo nustatyta, kad išskiriamų citokinų koncentracija lyginant su kontrole statistiškai patikimai išaugo tik po poveikio su PMA kartu su LPS, t.y., tik monocitus diferencijavus į makrofagus ir sukėlus uždegimą. Monocitų išskiriamų citokinų koncentracijos svyravimas po skirtingų koncentracijų ir skirtingo laiko oksiduotų MTL poveikių nebuvo statistiškai patikimas. Taip pat, buvo nustatyta, kad oksiduotų MTL poveikis statistiškai patikimai nepakeičia monocitų proliferecijos, tačiau visų mėginių, kuriems buvo sukelta diferenciacija į makrofagus, rezultatai rodo statistiškai patikimą 3% proliferacijos žymenų raiškos sumažėjimą.

Neseniai publikuotas biobanko duomenų tyrimas atskleidė teigiamą koreliaciją tarp periferinių virusinių infekcijų ir neurouždegiminių būklių, tačiau mechanizmas, jungiantis šias dvi būsenas, išlieka nežinomas. Vienas iš potencialių šio ryšio mechanizmų yra užląstelinės pūslelės, kurias išskiria kvėpavimo takų ląstelės. Šios pūslelės perneša įvairias biologiškai aktyvias molekules, pereina įvairius biologinius barjerus, todėl gali pasiekti ir centrinę nervų sistemą. Šio darbo tikslas – ištirti ir palyginti sveikų ir virusine seka poli I:C stimuliuotų kvėpavimo takų epitelio ląstelių išskiriamų užląstelinių pūslelių poveikį mikroglijos ląstelėms. Darbo metu iš poli I:C seka stimuliuotų žmogaus bronchų epitelio ląstelių ir iš nestimuliuotų ląstelių išskirtos užląstelinės pūslelės. Jos charakterizuotos pagal dalelių dydį, struktūrą, bendro baltymo, RNR kiekį bei paviršiaus krūvį. Nustatyta, kad nestimuliuotų ląstelių užląstelinių pūslelių dalelių dydis varijavo nuo 44,5 nm iki 345 nm, o poli I:C seka stimuliuotų ląstelių užląstelinių pūslelių – nuo 45,5 nm iki 400 nm. Pagal bendro baltymo ir išskirtos RNR kiekį pūslelės tarp grupių reikšmingai nesiskyrė, tačiau iš virusine seka stimuliuotų ląstelių išskirtos pūslelės turėjo polinkį sudaryti agregatus, nes pasižymėjo mažesniu paviršiaus krūviu. Išskirtomis užląstelinėmis pūslelėmis buvo veikiamos mikroglijos ląstelės, juose įvertinant metabolinį aktyvumą ir uždegiminių žymenų raišką. Nustatyta, kad mikroglijos metabolinis aktyvumas priklausė nuo užląstelinių pūslelių koncentracijos. Mikroglijos metabolinio aktyvumo padidėjimas nustatytas veikiant abiejų tipų užląstelinėmis pūslelėmis, naudojant 5x107 dalelių/10000 mikroglijos ląstelių užląstelinių pūslelių koncentraciją. Viruso mimetiku stimuliuotų kvėpavimo takų epitelio ląstelių užląstelinės pūslelės padidina TNF-α, IL-18 ir IFN-γ uždegimą skatinančių citokinų genų raišką, o nestimuliuotų ląstelių – padidina TNF-α, tačiau slopina IFN-γ raišką. Lyginant abejas užląstelinių pūslelių grupes reikšmingai skiriasi jų poveikis IL-6, NF-κB ir IFN-γ genų raiškai mikroglijos ląstelėse. Taigi, iš kvėpavimo takų epitelio ląstelių išskirtos užląstelinės pūslelės aktyvina mikrogliją ir moduliuoja jos uždegiminius procesus.

Tyrimo tikslas – Įvertinti santykinio leukocitų telomerų ilgio ir CTC1 geno polimorfizmo sąsajas su miokardo infarktu. Tyrimo uždaviniai: 1. Nustatyti ir palyginti santykinius leukocitų telomerų ilgius tarp pacientų, patyrusių miokardo infarktą ir kontrolinės grupės tiriamųjų. 2. Palyginti santykinius leukocitų telomerų ilgius tarp pacientų, patyrusių miokardo infarktą su ST ir be ST pakilimo. 3. Įvertinti CTC1 geno (rs3027234) vieno nukleotido polimorfizmo sąsajas su miokardo infarkto ir kontroline grupe. 4. Įvertinti CTC1 geno (rs3027234) vieno nukleotido polimorfizmų sąsajas su santykiniu leukocitų telomerų ilgiu miokardo infarkto ir kontrolinėje grupėje. Medžiaga ir metodai. Tyrimams naudoti dviejų tiriamųjų grupių DNR mėginiai – miokardo infarktą patyrusių asmenų ir kontrolinės grupės. Tiriamųjų grupės buvo vertintos pagal skirtingų lyčių ir amžiaus grupes. Sąsajoms tarp CTC1 geno vieno nukleotido polimorfizmo (VNP) ir miokardo infarkto nustatyti bei įvertinti leukocitų telomerų ilgiui atlikta tikro laiko polimerazės grandininė reakcija (TL-PGR). Tiriamųjų mėginiuose buvo apskaičiuoti telomerų DNR fragmentai ir referentinio vienos kopijos geno – globulino kiekiai. Santykinis telomerų ilgis nustatytas tyrimo metu naudojant dviejų rūšių pradmenis: telomerų ir globulino. Rezultatai ir išvados. MI patyrusių tiriamųjų santykinio leukocitų telomerų ilgio mediana yra 25 kartus didesnė nei kontrolinės grupės. MI grupėje telomeros buvo ilgesnės lyginant su kontroline grupe skirtingų lyčių ir amžiaus grupėse (p < 0,001). Santykinis leukocitų telomerų ilgis reikšmingai nesiskyrė palyginus STEMI ir NSTEMI grupių tiriamuosius. CTC1 rs3027234 VNP genotipų ir alelių dažniai statistiškai reikšmingai nesiskyrė palyginus MI ir kontrolinės grupės tiriamuosius. MI patyrusių asmenų ir kontrolinės grupės tiriamųjų CTC1 rs3027234 VNP genotipų ir alelių dažnių pasiskirstymas neturėjo sąsajų su santykiniu telomerų ilgiu. STEMI grupėje, lyginant alelius tarp vidutinio ir vyresnio amžiaus tiriamųjų, nustatyta, kad T alelis dažniau pasitaikė vidutinio amžiaus tiriamiesiems (27,6 proc. vs. 16,4 proc.) (p = 0,036).

Bakalauro baigiamojo darbo autorius: Enrika Baronaitė Tema: Krūties adenokarcinommos išskiriamų užląstelinių pūslelių reikšmė kardiovaskulinei sistemai Mokslinis vadovas: Dr. Aistė Jekabsone Atlikimo vieta: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Kardiologijos institutas, Vaistinių medžiagų ikiklinikinių tyrimų laboratorija Santraukos turinys: Šio bakalauro baigiamojo darbo tikslas buvo įvertinti krūties adenokarcinomos išskiriamų užląstelinių pūslelių (UP) poveikį kardiovaskulinės sistemos ląstelių funkcijai. Šiam tikslui pasiekti buvo iškelti trys uždaviniai: (1) išskirti krūties adenokarcinomos didelio ir mažo dydžio UP ir jas charakterizuoti, (2) nustatyti ir palyginti krūties adenokarcinomos skirtingo dydžio UP poveikį kardiomiocitų ir kraujagyslių endotelio ląstelių metaboliniam aktyvumui ir gyvybingumui, ir (3) ištirti krūties adenokarcinomos skirtingo dydžio UP svarbą kardiomiocitų ir kraujagyslių endotelio ląstelių bioenergetiniams procesams. Tyrimo metu buvo kultivuojama pirminių kardiomiocitų kultūra, paruošta iš 4-5 dienų Wistar veislės žiurkių širdžių bei pirminės žmogaus kraujagyslės endotelio ląstelės HUVEC. Skirtingo dydžio UP buvo išskirtos iš imortalizuotos žmogaus krūties adenokarcinomos ląstelių linijos MCF – 7 kultivavimo terpės, taikant polimerinio išsodinimo komerciniu EXO – prep reagentu ir centrifugavimo metodus. Bendro baltymo kiekis skirtingo dydžio pūslelių populiacijose nustatytas spektrofotometriniu Bradfordo metodu, bendras RNR kiekis mėginiuose įvertintas RNR išgryninimui panaudojant komercinį TRIzol reagentą. UP dydis įvertintas nanodalelių sekimo ir dinaminės šviesos sklaidos metodais. Taikant lazerinę mikroelektroforezę buvo išmatuotas UP zeta potencialas. UP poveikis kardiomiocitų ir HUVEC ląstelių gyvybingumui ir metaboliniam aktyvumui buvo įvertintas panaudojant PrestoBlue reagentą, mitochondrijų funkciniai pokyčiai nustatyti naudojant Seahorse XFp analizatorių. HUVEC ląstelių migracijos pokyčiai buvo vertinami in vitro žaizdos metodu, gauti vaizdai apdoroti ImageJ programiniu paketu. Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant Graphpad 10 programą. Nustatyta, kad MCF – 7 mažų UP (mUP) dydis siekė iki 400 nm, kai didelių UP (dUP) buvo daugiau nei 400 nm ir siekė net iki 1106 nm. Tiek mUP , tiek dUP pasižymėjo vienodu RNR kiekiu, tačiau dUP pasižymėjo didesniu baltymų kiekiu. MCF – 7 dUP ir mUP populiacijos reikšmingai sumažino kardiomiocitų ir endotelio ląstelių HUVEC metabolinį aktyvumą ir gyvybingumą bei slopino mitochondrijų funkciją. Taip pat, nuslopino HUVEC ląstelių migracijos potencialą. MCF-7 dUP kardiovaskulinės sistemos ląsteles veikė panašiai kaip mUP.

Vėžinių ląstelių sąveika turi reikšmingos įtakos trejopai neigiamo krūties vėžio (TNBC) atsparumui chemoterapiniams vaistams. Doksorubicinas ir paklitakselis yra vieni pagrindinių vaistų, vartojami gydyti šio tipo navikus.

Tyrimo tikslas buvo įvertinti TNBC ląstelių sąveikos įtaką atsparumui vaistams (doksorubicino ir paklitakseliui). Išskirtos ir charakterizuotos septynios fenotipiškai skirtingos MDA-MB-231 sublinijos.

Tyrimo metodai: imunofluorescencinis dažymas, MTT testas, žaizdos gijimo metodas, magnetinis 3D biospausdinimas sferoidų formavimui.

Rezultatai parodė, jog greičiau migruojančių D8 ląstelių derinys su doksorubicinui jautriomis F5 ląstelėmis padidina atsparumą paklitakseliui ląstelių vienasluoksnyje, bet ne sferoiduose. Doksorubicinui ir paklitakseliui atsparias H2 sublinijos ląsteles derinant su greičiau migruojančiomis D8 arba doksorubicinui jautriomis F5 ląstelėmis, padidėja atsparumas paklitakseliui ląstelių vienasluoksnyje, bet sumažėja atsparumas abiem junginiams sferoiduose. Doksorubicino transportas į sublinijų ląsteles skiriasi: F5 sublinijos ląstelėse kaupiasi daugiausiai doksorubicino, o H2 – mažiausiai, tiek ląstelių vienasluoksnyje, tiek sferoiduose. Esant deguonies trūkumui ląstelių aplinkoje (hipoksijoje), doksorubicino transportas sumažėja visose sublinijose lyginant su įprastine deguonies koncentracija (normoksija).

Altered metabolism is a hallmark of cancer. Amino acid metabolism is often disrupted in tumours to meet increased demands for building blocks and energy. This dissertation explores the role of amino acids in breast cancer cell metabolism using various -omics techniques and bioinformatics to identify potential chemotherapeutic targets. Objectives included examining the role of branched-chain amino acids (BCAAs) in cellular energetics and mevalonate biosynthesis using isotopically labelled amino acids in breast cancer cells, comparing BCAA metabolism in the blood plasma of breast cancer patients and healthy controls, and identifying alterations in amino acid metabolism by integrating metabolomic and transcriptomic data. Methods used were UPLC-ESI-MS/MS, isotope labelling, RNA sequencing, wound healing assay, and integrated genome-metabolome analysis. Results show that 34 % and 14 % of energy in MCF-7 and BCC breast cancer cells, respectively, come from BCAA degradation. Additionally, 67 % and 22 % of carbon in leucine is converted to mevalonate in MCF-7 and BCC cells, respectively. Inhibition of BCAA metabolism reduces breast cancer cell invasiveness. Three BCAA metabolites - 3-hydroxyisovalerate, 3-hydroxyisobutyrate, and mevalonate - are potential biomarkers for early breast cancer detection. Genes AHCY, PHGDH, PSPH, and CHAC1 in methionine and serine metabolism are potential drug targets for breast cancer.